ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubo soldado dúplex para compoñente químico da industria química, a deficiencia de SPECC1L leva a unha maior estabilidade das articulacións empalmadas e unha redución do desprendimento das células da crista neural craniana.

Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Tubo soldado dúplex para industria química

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.é un fabricante líder que está especializado en tubos sen costura de aceiro inoxidable , tubos recocidos brillantes , tubos enrolados sen costura , etc .Co fin de facilitar aos clientes , temos tubos soldados e tubos tamén .Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ten o equipo de produción e proba máis avanzado .Podemos satisfacer totalmente a súa esixencia .Segundo o estándar moi estritamente , os tubos producidos por nós sempre teñen tolerancia correcta OD e WT .O control de tolerancia é estrictamente acorde para producir normas .Os nosos produtos están sempre satisfeitos cos clientes .Os clientes que compraron os nosos produtos crearon máis beneficios.
a) OD (diámetro exterior): 3,18 mm a 101,6 mm
b) Peso (grosor da parede): 0,5 mm a 20 mm
c) Lonxitude: segundo o requisito do cliente
d) Normas: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Método de proceso: ERW, EFW, etc

Control deslizante que mostra tres artigos por diapositiva.Usa os botóns atrás e seguinte para moverte polas diapositivas ou os botóns do controlador de diapositivas ao final para moverte por cada diapositiva.
As células da crista neural cranial (CNCC) despréndense dos pregamentos neuronais embrionarios e migran cara aos arcos farínxeos, que forman a maioría das estruturas medias da cara.A disfunción do CNCC xoga un papel importante na etioloxía da fenda orofacial, unha malformación conxénita común.Atopáronse mutacións heterocigotas SPECC1L en pacientes con fendas atípicas e sindrómicas.Aquí, informamos da tinción mellorada de compoñentes de unión adhesiva canónica (AJ), β-catenina e E-cadherina en células de caída SPECC1L cultivadas, e as micrografías electrónicas mostran a difusión apical-basal de AJ.Para comprender o papel de SPECC1L na morfoxénese craneofacial, creamos un modelo de rato deficiente en Specc1l.Os mutantes homocigotos son letais embrionarias e presentan alteracións no peche do tubo neural e na laminación CNCC.A tinción de proteínas AJ aumenta nos pregamentos neuronais mutantes.Este defecto AJ é consistente cun defecto na delaminación CNCC, que require a disolución de AJ.Ademais, os mutantes Specc11 reduciron a sinalización de PI3K-AKT e aumentaron a apoptose.In vitro, a inhibición leve da sinalización de PI3K-AKT en células de tipo salvaxe foi suficiente para inducir cambios AJ.É importante destacar que os cambios de AJ inducidos pola caída de SPECC1L pódense reverter mediante a activación da vía PI3K-AKT.En conxunto, estes datos suxiren que SPECC1L, como un novo regulador da sinalización PI3K-AKT e da bioloxía AJ, é necesario para o peche do tubo neural e a estratificación CNCC.
As células da cresta neural craneal (CNCC) localízanse no neuroectodermo dorsal e despréndense do neuroepitelio dos pregamentos neuronais en desenvolvemento mediante un proceso que implica a transición epitelial-mesenquimal (EMT)1,2,3.As CNCC epiteliais premigratorias interrompen as unións intercelulares e convértense en CNCC mesenquimales migrantes que enchen o primeiro e o segundo arcos farínxeos e forman a maior parte da cartilaxe craneofacial.Así, os xenes que regulan a función CNCC adoitan interromperse na etioloxía das anomalías conxénitas craneofaciais, como as fendas orofaciais, que afectan máis comúnmente a 1/800 nacementos só nos EE.Unha das deformidades conxénitas8.
A delaminación do CNCC coincide co peche do tubo neural anterior entre 8,5 e 9,5 días de desenvolvemento embrionario en ratos.Os mutantes de varios xenes asociados á fenda orofacial de rato tamén presentan algún tipo de defecto do tubo neural, incluíndo Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 e Pdgfrα12.Non obstante, os procesos de peche do tubo neural e estratificación CNCC poden considerarse independentes, xa que o rato mutante Splotch (Pax3) presenta defectos no peche do tubo neural sen ningún efecto na estratificación ou migración CNCC 13,14.Os modelos de rato adicionais con defectos na disección CNCC e o peche do tubo neural axudarán a delimitar a base molecular común destes dous procesos.
O illamento de CNCC das células neuroepiteliais require a disolución das unións adhesivas (AJ), que están compostas por complexos proteicos que conteñen, entre outros, E-cadherina, β-catenina, α-E-catenina e α-actinina asociada a filamentos de actina 2. Estudos de sobreexpresión de E-cadherina en pregamentos neuronais mostraron unha redución ou atraso na delaminación CNCC.Pola contra, a supresión da E-cadherina resulta nunha estratificación precoz15,16.Moitos dos factores que median a EMT durante a estratificación CNCC son factores de transcrición (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) e proteínas de remodelación da matriz extracelular (ECM), como as metaloproteinases da matriz (MMPs), pero as CNCC son reguladores directos de AJ citoesquelético. aínda non coñecido.Sábese que a vía PI3K-AKT antagoniza os niveis de E-cadherina, principalmente pola investigación do cancro17.Estudos recentes demostraron que a perda de sinalización PI3K-AKT baseada en PDGFα en ratos leva a anomalías craneofaciais, incluíndo defectos do padal leporino e do tubo neural12.Non obstante, a relación entre a vía PI3K-AKT e a estabilidade de AJ tras a estratificación CNCC non está clara.
Previamente identificamos SPECC1L como o primeiro xene mutante en dúas persoas cunha fenda grave que se estende desde a boca ata o ollo, coñecida como fenda oblicua (ObFC) ou fenda Tessier IV18.Identificáronse mutacións SPECC1L en dúas familias multixeracionais coa síndrome de Opitz G/BBB autosómica dominante (OMIM #145410), nas que os individuos afectados mostraban hiperdistancia e labio/palatino leporino19, e nunha familia con síndrome de sobredistancia Tibi (OMIM #145420)20 .máis da metade dos casos de síndrome de Opitz G/BBB están ligados a X (OMIM #300000) e son causados ​​por mutacións no xene MID1, que codifica a proteína 22 do esqueleto celular asociado aos microtúbulos.A hipótese de que SPECC1L, tamén unha proteína asociada aos microtúbulos e ao citoesqueleto de actina, pode mediar na sinalización necesaria para a remodelación do citoesqueleto de actina durante a adhesión celular e a migración 18 .A través de estudos in vitro e in vivo, agora describimos SPECC1L como un novo regulador da estabilidade de AJ mediante a sinalización PI3K-AKT.A nivel celular, a deficiencia de SPECC1L provocou unha diminución do nivel da proteína pan-AKT e un aumento da dispersión apical-basal de AJ, que foi eliminada pola activación química da vía AKT.In vivo, os embrións con deficiencia de Specc11 mostran un peche do tubo neural deteriorado e unha redución da disección CNCC.Así, SPECC1L funciona na sinalización baseada na adhesión celular altamente regulada necesaria para a función normal do CNCC durante a morfoxénese facial.
Para caracterizar o papel de SPECC1L a nivel celular, utilizamos a liña celular estable de osteosarcoma descrita anteriormente con deficiencia U2OS en SPECC1L18.Estas células U2OS estables con derrubamento de SPECC1L (kd) tiveron unha diminución moderada (60-70%) dos niveis de transcritos e proteínas SPECC1L, xunto con defectos na migración e reorganización do citoesqueleto de actina 18. En cambio, unha diminución transitoria severa no Demostrouse que SPECC1L conduce a defectos mitóticos 23 .Tras unha caracterización posterior, descubrimos que as nosas células estables SPECC1L-kd cambiaron a morfoloxía nun grao de confluencia moi alto (figura 1).As células de control individuais e as células kd en baixa confluencia parecían similares (Figura 1A, D).24 horas despois da fusión, as células control mantiveron a súa forma cuboidal (Fig. 1B, E), mentres que as células SPECC1L-kd alongáronse (Fig. 1C, F).O alcance deste cambio na forma celular foi capturado mediante imaxes en vivo in vivo de células control e células kd (película 1).Para determinar o papel de SPECC1L nas células confluentes, primeiro examinamos a súa expresión.Descubrimos que os niveis de proteína SPECC1L aumentaron tras a fusión (Figura 1G), mentres que os niveis de transcrición SPECC1L non aumentaron (Figura 1H).Ademais, a medida que aumentou a densidade celular, a proteína SPECC1L acumulouse nos límites intercelulares (Fig. 2A-E), cun patrón que se solapa co da β-catenina asociada á membrana (Fig. 2A'-E').Dada a asociación de SPECC1L co citoesqueleto de actina 18,23 plantexamos a hipótese de que SPECC1L interactúa coas unións adhesivas baseadas en actina (AJ).
(AF) As células SPECC1L knockdown (DF) elonganse en alta confluencia (F) en comparación coas células control U2OS (AC).Aquí móstranse tres dos seis puntos de tempo (T1, T3, T6) que seleccionamos para diferentes densidades celulares.(G) Análise Western blot que mostra que a proteína SPECC1L está estabilizada nun alto grao de confluencia en comparación cun baixo grao de confluencia nas células control.Western blot de SPECC1L mostra a banda esperada de 120 kDa e unha banda de maior peso molecular, posiblemente modificada posteriormente á tradución (*).A análise de Western blot realizouse nas mesmas condicións para a confluencia baixa e alta.As imaxes que mostran SPECC1L en baixa e alta confluencia foron tomadas da mesma mancha.A mesma mancha foi eliminada e reexaminada con anticorpo β-actina.(H) A análise cuantitativa de RT-PCR non mostrou cambios significativos nos niveis de transcrición SPECC1L.As barras de erro representan SEM de catro experimentos independentes.
(AE) Escollemos seis puntos de tempo (T1-T6) que representan un rango de densidades celulares para normalizar a análise da forma celular e os cambios de AJ nas células U2OS con eliminación de SPECC1L (kd).Os primeiros cinco destes puntos de tempo incluíron células individuais (T1), fusión do 50-70% de grupos de células pequenas (T2), fusión sen remodelar células kd (T3), remodelar células kd (T4) e cambios de 24 horas.na forma posterior das células kd (T5).A proteína SPECC1L dispersouse predominantemente no citoplasma en T1 (A), pero a súa acumulación observouse nos límites intercelulares en puntos de tempo posteriores (B-E, frechas).(FJ) β-catenina mostra unha acumulación similar nos límites intercelulares asociados co complexo AJ.(A'-E') SPECC1L e β-catenina mostran corduras superpostas nos bordos das células a alta densidade celular (frechas).(F'-J') Nas células SPECC1L-kd, a tinción de β-catenina parece normal a baixa densidade celular (F'-H'), pero se expande a medida que cambia a forma celular (I', J'; frechas), o que indica que AJ cambiaron.Barras = 10 µm.
Despois tentamos determinar o efecto da deficiencia de SPECC1L sobre AJ.Usamos varios marcadores asociados a AJ, incluíndo os compoñentes canónicos F-actina, miosina IIb, β-catenina e E-cadherina24,25,26,27.As fibras de estrés de actina aumentaron nas células SPECC1L-kd como se describiu anteriormente (Fig. 3A, B) 18 .A miosina IIb asociada aos filamentos de actina mostrou un aumento similar nas células SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).A β-catenina asociada a AJ únese á cadherina na membrana celular, mostrando un patrón de expresión normal en "panal" nos cubocitos de control (Fig. 3E, G).Curiosamente, en imaxes planas mediante microscopía confocal, a β-catenina (Fig. 3E, F) e E-cadherina (Fig. 3G, H) a tinción na membrana celular de células confluentes deficientes en SPECC1L mostraron patróns destacados de tinción estendida.Esta expansión da tinción de β-catenina asociada a AJ nas células kd foi máis pronunciada na confluencia, pero parecía preceder aos cambios na forma celular (Fig. 2F-J, F'-J').Para determinar a natureza física desta tinción AJ estendida, examinamos os bordos das células na superficie apical-basal das células SPECC1L-kd U2OS mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 3I, J).En contraste coas células de control (Fig. 3I), que tiñan rexións densas de electróns separadas indicativas de AJ (frechas), as células kd (Fig. 3J) mostraban grandes rexións contiguas de alta densidade electrónica indicativa de AJ ao longo do plano apicobasal..Ademais, en seccións transversais, observamos extensas dobras da membrana celular nas células kd (Fig. S1A, B), o que explica o patrón estendido de bandas de tinción de β-catenina e E-cadherina (Fig. 3F, H).En apoio do papel de SPECC1L en AJs, a β-catenina foi co-inmunoprecipitada con SPECC1L en lisados ​​de células U2OS confluentes (Fig. 3K).Xunto coa inmunotinción estendida para os marcadores AJ, a análise TEM foi consistente coa nosa hipótese de que a deficiencia de SPECC1L aumenta a densidade e varianza apical-basal de AJ.
(AH) Aumento da tinción de actina F nas células kd 48 horas despois da fusión (T6; A, B).Tinción alterada da miosina IIb asociada á actina F (C, D).O patrón suave da tinción da membrana de β-catenina e E-cadherina nas células control (E, G) mellorou nas células SPECC1L-kd (F, H).Barras = 10 µm.(I–J) Micrografías electrónicas observando a unión intercelular apical-basal.As celas de control mostran distintas rexións densas en electróns que indican unións pegajosas (I, frechas).Pola contra, toda a unión apical-basal nas células SPECC1L-kd parecía densa de electróns (J, frechas), o que indicaba unha densidade e dispersión aumentadas das unións adhesivas.(K) A β-catenina foi co-inmunoprecipitada con SPECC1L en lisados ​​de células U2OS confluentes.Imaxe tomada dun punto que representa un dos catro experimentos independentes.
Para comprender o papel de SPECC1L na morfoxénese craneofacial, creamos un modelo de rato deficiente en Specc1l usando dúas liñas celulares de trampa ES independentes, DTM096 e RRH048 (BayGenomics, CA), que representan o intrón 1 e as transcricións de Specc1l foron capturadas ás 15 (Fig. 1). .4A, figura S2).A localización xenómica da inserción do vector señuelo determinouse mediante a secuenciación do xenoma completo e confirmouse mediante PCR (Fig. S2).Os dous deseños de trampas xenéticas tamén permitiron a fusión no cadro dos reporteiros Specc11-lacZ tras a captura.Polo tanto, a expresión de lacZ determinada pola tinción con X-gal utilizouse como indicador da expresión de Specc11.Ambos alelos mostraron patróns de expresión de lacZ similares, coa trampa do xene DTM096 no intrón 1 mostrando unha expresión máis forte que RRH048 no intrón 15 (non mostrado).Non obstante, Specc1l exprésase amplamente, cunha expresión particularmente forte nos pregamentos neuronais en E8.5 (Figura 4B), no tubo neural e nos procesos faciais en E9.5 e E10.5 (Figura 4C,D) e nos membros en desenvolvemento. á E10.5 e ollos (Figura 4D).Previamente informamos de que a expresión de SPECC1L no primeiro arco farínxeo en E10.5 estaba presente no epitelio e no mesénquima subxacente18, de acordo coa liñaxe CNCC.Para probar a expresión de SPECC1L en CNCC, realizamos seccións de cranio E8.5 (Figura 4E-J) e E9.5 (Figura 4K-).En E8.5, SPECC1L tinguiu intensamente os pregamentos neuronais (Fig. 4E, H), incluíndo células tinguidas con marcadores NCC (Fig. 4G, J).En E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) fortemente manchada migrando CNCC co-tinxida con AP2A (Fig. 4L, M) ou SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Representación esquemática do xene Specc11 do rato que mostra a inserción do vector señuelo nos clons de células ES DTM096 (intrón 1) e RRH048 (intrón 15).(BD) tinción lacZ de embrións heterocigotos Specc1lDTM096 que representan a expresión Specc1l de E8.5 a E10.5.NE = neuroectodermo, NF = pregamento neural, PA1 = primeiro arco farínxeo.(EP) Inmunotinción SPECC1L con marcadores NCC AP2A e SOX10 en pregamentos neuronais E8.5 (NF; EJ) e seccións de cranio E9.5 (KP).A tinción SPECC1L observouse amplamente nos pregamentos neuronais E8.5 (E, H; puntas de frecha), incluíndo células marcadas con AP2A (F, G; puntas de frecha) e SOX10 (I, J; puntas de frecha).En E9.5, SPECC1L tinguiu fortemente as CNCCs migratorias (K, N; frechas) marcadas como AP2A (L, M; frechas) e SOX10 (O, P; frechas).
O cruzamento entre ratos heterocigotos Specc1lDTM096/+ e Specc1lRRH048/+ mostra que os dous alelos de trampa de xenes non son complementarios e que os heterocigotos compostos e os homocigotos embrionarios para calquera dos alelos de trampa de xenes son letais embrionarias (táboa S1).As proporcións mendelianas indicaron unha diminución da taxa de supervivencia dos heterocigotos ao nacer (esperado 1,34 fronte a 2,0).Observamos unha baixa mortalidade perinatal entre os heterocigotos, algúns tiñan anomalías craneofaciales (Fig. S3).Non obstante, a baixa penetrancia destes fenotipos craneofaciais perinatais dificulta o estudo dos seus mecanismos fisiopatolóxicos subxacentes.Polo tanto, centrámonos no fenotipo letal embrionario dos mutantes homocigotos Specc11.
A maioría dos embrións mutantes heterocigotos ou homocigotos Specc1lDTM096/RRH048 compostos non se desenvolveron despois de E9.5-10.5 (Figs. 5A-D), e o tubo neural non se pechou anteriormente (Figuras 5B, D) e ás veces pechouse posteriormente (non se mostra). ..Este defecto de peche do tubo neural craneal estivo asociado coa maioría dos DLX2 marcados por CNCC que permanecen nos pregamentos neuronais en E10.5, o que indica que non hai disección (Figura 5A'-D').Para determinar se o tamaño total do CNCC tamén se reduciu, marcamos as liñas CNCC con GFP nas nosas liñas de trampa xenética con Wnt1-Cre e ROSAmTmG.Transmitimos en fluxo GFP+ NCC e GFP- (RFP+) non NCC de embrións enteiros.En E9.5, a proporción de CNCC marcados con GFP clasificados por fluxo non cambiou significativamente entre WT e embrións mutantes (non mostrados), o que indica a especificación normal de CNCC.Polo tanto, plantexamos a hipótese de que a tinción residual de Wnt1-Cre e DLX2 nos pregamentos neuronais expostos (Figura 5B') debeuse a unha capa defectuosa de CNCC, posiblemente debido ao aumento da densidade ou dispersión das células AJ, como se observa nas células SPECC1L-kd.Usamos os marcadores NCC SOX10, AP2A e DLX2 para confirmar a presenza de CNCC no pregamento neural (Figura 5E-R).En E8.5, observouse a tinción do pregamento neural para os tres marcadores NCC en seccións de WT (Fig. 5E, G, I) e Specc1l mutante (Fig. 5F, H, J).En E9.5, mentres que os marcadores NCC manchaban NCC en migración en seccións de WT (Fig. 5M, O, Q), observouse a tinción residual de NCC en pregamentos neurais expostos de embrións mutantes Specc1l (Fig. 5N, P, R).Debido a que SOX10 e DLX2 marcan CNCCs migratorios, este resultado suxire que os CNCC deficientes en SPECC1L logran a especificación postmigratoria pero non logran migrar desde os pregamentos neuronais.
A deficiencia de Specc11 leva a un peche defectuoso do tubo neural, a delaminación das células da crista neural cranial e AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrión que leva células migratorias da cresta neural cranial (CNCC) marcadas con Wnt1-Cre (A').Pola contra, os embrións mutantes Specc11 mostran pregamentos neuronais abertos (B), puntas de frecha) e CNCC que non migraron (B', puntas de frecha).(C, D') Imaxes de campo brillante (C, D') e inmunotinción (C', D') do marcador CNCC DLX2 de embrións E10.5 WT (C, C') e Specc1l (D, D').Nos embrións WT E10.5, CNCC DLX2-positivo colonizan os arcos branquiais (C', frechas), mentres que nos mutantes, a tinción conspicua persiste nos pregamentos neurais abertos (D', frechas) e nos primeiros arcos farínxeos (D', frechas).) con algunhas manchas (frechas) que indican unha mala delaminación e migración de CNCC.ER) Seccións de embrións mutantes WT e Specc1l nas etapas E8.5 (E-L) e E9.5 (M-R) foron etiquetadas con marcadores NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) e DLX2 (I, J, Q, R).En E8.5, observouse a tinción de NCC en seccións de pregamento neural de tipo salvaxe (NF) e mutantes.A co-tinción de SOX10 e β-catenina en E8.5 WT (K) e mutante (L) revelou un aumento da tinción de β-catenina nos límites celulares dos pregamentos neuronais.En E9.5, observouse a tinción de tipo salvaxe de CNCC en migración (M, O, Q), mentres que nos mutantes, os CNCC non estratificados tinguiron pregamentos neurais abertos (N, P, R).(S–Z) Análise de marcado AJ in vivo en seccións coronais de embrións WT e Specc11DTM096/RRH048 coa mutación E9.5.Na esquina superior dereita móstrase un plano de sección aproximado.En seccións de tecidos mutantes, observouse un aumento da tinción de actina F (S, T) e miosina IIb (U, V).Semellante aos resultados in vitro da figura 3, en embrións mutantes, observouse unha tinción de membrana mellorada para β-catenina (W, X) e E-cadherina (Y, Z).(AA-BB) Unha micrografía electrónica dunha sección dun embrión de tipo salvaxe mirando máis aló do bordo da célula apical-basal mostra unha rexión densa de electróns distinta indicativa de unións adhesivas (AA, frechas).Pola contra, en seccións de embrións mutantes Specc11 (BB, frechas), toda a unión apicobasal é densa en electróns, o que indica unha maior densidade e dispersión das unións adhesivas.
Para probar a nosa hipótese de que a redución de capas débese á alteración da AJ, examinamos a etiquetaxe de AJ en pregamentos neurais expostos de embrións mutantes Specc1l (Fig. 5S-Z).Observamos un aumento das fibras de estrés de actina (Fig. 5S, T) e un aumento concomitante da localización da tinción de miosina IIB nas fibras de actina (Fig. 5U, V).É importante destacar que observamos un aumento da cor de β-catenina (Fig. 5W, X) e E-cadherina (Fig. 5Y, Z) nos límites intercelulares.Tamén examinamos a tinción de β-catenina de NCC nos pregamentos neuronais dos embrións E8.5 (Fig. 5K, L).A tinción de β-catenina parecía ser máis forte nos pregamentos neuronais mutantes Specc1l (Fig. 5L e K), o que suxire que os cambios AJ comezaran.En micrografías electrónicas de seccións de cranio de embrións E9.5, observamos de novo un aumento da tinción difusa de electróns densos nos embrións mutantes Specc1l en comparación co WT (Fig. 5AA, BB e S1E-H).En conxunto, estes resultados apoian os nosos resultados in vitro en células SPECC1L-kd U2OS e suxiren que a tinción aberrante de AJ precede á estratificación CNCC nos nosos embrións mutantes.
Dada a coñecida relación antagónica entre a actividade de AKT e a estabilidade da E-cadherina,17,28 plantexamos a hipótese da implicación da sinalización PI3K-AKT.Ademais, observamos burbullas subepidérmicas nalgúns dos nosos embrións mutantes que escaparon da letalidade (<5%) en E9.5-10.5 e, en cambio, establecéronse en torno a E13.5 (Fig. S3).As vesículas subepidérmicas son un selo distintivo da redución da sinalización PI3K-AKT baseada en PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) informaron de que a interrupción da activación de PI3K baseada en PDGFRα en embrións mutantes PdgfraPI3K/PI3K produce vesículas subepidérmicas, defectos do tubo neural e fenotipos do padal leporino.De feito, os niveis de pan-AKT e de Ser473-AKT fosforilado activo reducíronse in vivo nos tecidos mutantes Specc1l ata o paro embrionario E9.5 (Fig. 6A-D).A diminución dos niveis de Ser473-AKT fosforilado pode deberse enteiramente á diminución dos niveis de pan-AKT in vivo (FIG. 6E) e in vitro (FIGURA 6F).Só se observou unha diminución in vitro cando as células U2OS confluían fortemente con cambios na forma celular e na densidade de AJ (Figura 6D).Así, os nosos datos suxiren que SPECC1L é un novo regulador positivo da sinalización PI3K-AKT na morfoxénese craneofacial.
(A-E) Seccións de cranio E8.5 (A,B) e E9.5 (C,D) ou lisados ​​E9.5 de embrións mutantes Specc1l (E) que mostran niveis de redución de proteínas S473-AKT fosforilado activo e pan-AKT , en comparación co control WT.A transferencia Western realizouse en lisados ​​de tipo salvaxe e lisados ​​mutantes nas mesmas condicións.As imaxes mostradas para SPECC1L foron tomadas dunha mancha.A mesma mancha foi eliminada e reexaminada con anticorpos anti-pan-ACT e β-actina.Os niveis de Pan-AKT nos pregamentos neuronais E8.5 (A, B) e os niveis de S473-AKT fosforilado nas seccións de cranio E9.5 reducíronse significativamente.(F) Os niveis de Pan-AKT reducíronse de xeito similar nos lisados ​​de células SPECC1L-kd U2OS collidas en alta confluencia.As barras de erro representan SEM de tres cuantificacións Western blot independentes.(GJ) Seccións de embrións WT en E9.5 tinguidas con KI67 e caspase 3 escindida, respectivamente, mostrando proliferación celular (G, G') e pouca actividade apoptótica (H, H').Os embrións mutantes Specc11 mostran unha proliferación celular comparable (I), pero o número de células que sofren apoptose aumenta significativamente (J).
Despois examinamos os marcadores de proliferación e apoptose.Non observamos ningunha diferenza na proliferación de embrións E9.5 (Fig. 6E, G en comparación con I) cun índice de proliferación do 82,5% para os mutantes WT e do 86,5% para os mutantes Specc1l medido pola tinción KI67 (p <0,56, Fisher's). proba exacta).Do mesmo xeito, non observamos ningunha diferenza na apoptose medida coa tinción para a caspase 3 escindida en pregamentos neuronais en E8.5 ata a detención do embrión (non mostrado) (non mostrado).Pola contra, a apoptose aumentou significativamente en todos os embrións mutantes E9.5 (Fig. 6F, H e J).Este aumento global da apoptose é consistente coa redución da sinalización PI3K-AKT e a letalidade embrionaria precoz29,30,31.
A continuación, para confirmar un papel causal da sinalización PI3K-AKT nos cambios de AJ nas nosas células kd, alteramos quimicamente a vía nas células control e kd (Figura 7A-F).Usamos como marcador o fenotipo de cambio de forma celular observado nas células SPECC1L-kd confluentes, que cuantificamos mediante a relación entre a dimensión máis longa (lonxitude) e a dimensión vertical correspondente (ancho).Espérase unha proporción de 1 para células relativamente redondas ou cúbicas (Figura 7G).Ademais da forma da célula, tamén confirmamos o efecto sobre AJ mediante a tinción de β-catenina (Fig. 7A'-F').A inhibición da vía PI3K-AKT usando wortmanina foi suficiente para cambiar a forma celular nas células control (Figura 7A, C) e AJ (Figura 7A').O activador PI3K-AKT SC-79 non afectou á forma celular (FIG. 7A, E) nin á expansión AJ (FIG. 7A') nas células control.Nas células SPECC1L-kd, unha maior supresión da vía PI3K-AKT provocou un aumento da apoptose (Fig. 7B, D) e un marcado aumento da tinción de β-catenina (Fig. 7B'), consistente cos nosos mutantes pesados ​​in vivo.É importante destacar que a activación da vía PI3K-AKT mellorou significativamente a forma celular (Figura 7B, F) e os fenotipos AJ (Figura 7B).Os cambios na forma da célula cuantificáronse como relación de redondez celular (CCR) e comparáronse a súa importancia como se describe anteriormente (Figura 7G).De feito, nas células control (Fig. 7G, CCR = 1,56), o tratamento con wortmanina foi suficiente para alterar significativamente a forma celular (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) ata un punto similar ao observado. en SPECC1L.-kd células (Fig. 7G, CCR = 3,46).O tratamento con wortmannina das células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, insignificante) non foi máis significativo que as células kd non tratadas (Fig. 7G, CCR = 3,46, insignificante) ou as células de control tratadas con wortmannina (Fig. 7G)., CCR = 3,46, insignificante) afecta adicionalmente ao alongamento celular (7G, CCR = 3,61, insignificante).O máis importante é que o activador SC-79 AKT restaurou o fenotipo alongado das células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Estes resultados confirman que SPECC1L regula a sinalización PI3K-AKT e suxiren que unha diminución moderada de SPECC1L afecta á adhesión celular, mentres que unha forte diminución leva á apoptose (Fig. 8).
(A-F') Células control (A, C, E) e SPECC1L-kd (B, D, F) tratadas con inhibidor da vía PI3K-AKT wortmanina (C, D) ou activador SC-79 (E, F) Tratamento .As células control non tratadas son cúbicas (A) cunha tinción normal de células β-cat (A'), mentres que as células kd son alongadas (B) cunha tinción β-cat aumentada (B').Despois da supresión da vía PI3K-AKT, as células de control alongáronse (C) coa expansión do gato β (C'), mentres que as células kd comezaron a sufrir apoptose (D), de forma similar aos nosos embrións altamente mutados e que mostraban un gato β moi mellorado.tinción (D').Despois da activación da vía PI3K-AKT, as células de control permaneceron cuboides (E) e tiñan unha tinción normal de β-cat (E'), mentres que as células kd mostraron unha mellora significativa na forma celular (F) e na tinción β-cat (F'), o que indica (G) O grao de cambio de forma da célula (AF) cuantificouse mediante a relación de redondez das células (CCR) da dimensión máis longa (lonxitude) e a dimensión vertical correspondente (ancho) usando o software MetaMorph.As células SPECC1L-kd non tratadas (NT) (CCR = 3,46) foron significativamente máis longas que as células control (CCR = 1,56, p <6,1 × 10-13).A inhibición do mosto da vía PI3K-AKT nas células control foi suficiente para provocar un alongamento similar na forma celular (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Do mesmo xeito, a activación de AKT por SC-79 nas células SPECC1L-kd restaurou o alongamento celular aos niveis de control (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).O tratamento con wortmannina das células SPECC1L-kd deu lugar a un aumento da apoptose pero non aumentou máis no cambio de forma celular (CCR=3,60) en comparación coas células control non tratadas (CCR=3,46, ns) ou tratadas con wortmanina (3,61) observadas en .ns = non importa.Amósanse as medicións de +/- SEM para 50 celas.As diferenzas estatísticas calculáronse mediante a proba t de Student.
(A) Representación esquemática da inhibición e activación da vía PI3K-AKT que orixina cambios de AJ e rescate, respectivamente.(B) Modelo proposto para a estabilización da proteína AKT por SPECC1L.
As CNCC premigratorias requiren a lise de AJ para separarse das células neuroepiteliais do pregamento neural anterior1,15,32.O aumento da tinción dos compoñentes de AJ e a perda da distribución asimétrica apical-basal de AJ en células deficientes en SPECC1L tanto in vitro como in vivo, combinado coa proximidade física de SPECC1L á β-catenina, suxiren que SPECC1L funciona para manter adecuadamente a estabilidade local de AJ para músculos da organización.citoesqueleto de actina.A asociación de SPECC1L co citoesqueleto de actina e a β-catenina e o aumento do número de filamentos de actina condensados ​​en ausencia de SPECC1L é consistente co aumento observado na densidade de AJ.Outra posibilidade é que un aumento do número de fibras de actina nas células deficientes en SPECC1L leve a un cambio na tensión intercelular.Debido a que o estrés celular afecta á dinámica do AJ 33, os cambios de voltaxe poden producir un AJ 34 máis difuso.Polo tanto, calquera cambio afectará ás capas CNCC.
Wnt1 exprésase nos primeiros pregamentos neuronais que orixinan células da crista neural.Así, o rastrexo da liñaxe Wnt1-cre marca a NCC35 previa e migratoria.Non obstante, Wnt1 tamén marca os clons de tecido cerebral dorsal derivados tamén de pregamentos neuronais iniciais 35,36, polo que é probable que a nosa tinción de mutantes E9.5 para marcadores Wnt1 en pregamentos neuronais abertos non sexa CNCC.A nosa tinción positiva para os marcadores NCC AP2A e SOX10 confirmou que os pregamentos neuronais expostos dos embrións mutantes Specc11 contiñan de feito CNCC.Ademais, dado que AP2A e SOX10 son marcadores de NCC migratorio precoz, a tinción positiva indicaba que estas células son CNCC postmigratorias que non se poden estratificar por E9.5.
Os nosos datos suxiren que a regulación molecular de AJ por SPECC1L está mediada pola sinalización PI3K-AKT.A sinalización AKT redúcese en células e tecidos deficientes en SPECC1L.Achados de Fantauzzo et al.apoiar un papel directo para a sinalización PI3K-AKT na morfoxénese craneofacial.(2014) demostraron que a falta de activación da sinalización PI3K-AKT baseada en PDGFRα leva a un fenotipo do padal leporino.Tamén mostramos que a inhibición da vía PI3K-AKT é suficiente para cambiar AJ e a forma celular nas células U2OS.En consonancia cos nosos descubrimentos, Cain et al.37 mostrou que a regulación á baixa da subunidade PI3K α110 nas células endoteliais produce un aumento similar na tinción pericelular de β-catenina, denominado aumento do "índice de conectividade".Porén, nas células endoteliais cuxos filamentos de actina xa están moi organizados, a supresión da vía PI3K-AKT dá lugar a unha forma celular solta.Pola contra, as células SPECC1L-kd U2OS mostraron unha forma de célula alongada.Esta diferenza pode ser específica do tipo celular.Aínda que a supresión da sinalización PI3K-AKT afecta permanentemente ao citoesqueleto de actina, o efecto sobre a forma celular está determinado polos cambios na tensión causados ​​polos cambios na densidade e na organización das fibras de actina centrais.Nas células U2OS, só usamos os cambios de forma das células como un marcador de cambio e recuperación de AJ deficiente en SPECC1L.En conclusión, hipotetizamos que a inhibición da vía AKT na deficiencia de SPECC1L aumenta a estabilidade do AJ e reduce a delaminación no CNCC.
Curiosamente, os niveis de pan-AKT reducíronse in vitro e in vivo ademais dos niveis de 473-AKT fosforilados en ausencia de SPECC1L, o que suxire a regulación da sinalización PI3K-AKT a nivel de estabilidade ou recambio da proteína AKT.Os xenes SPECC1L e MID1, ambos asociados coa síndrome de Opitz/GBBB, codifican proteínas que estabilizan os microtúbulos 18,22.Non se comprende completamente o mecanismo polo cal SPECC1L e MID1 median na estabilización dos microtúbulos.No caso de SPECC1L, esta estabilización inclúe a acetilación mellorada dun subconxunto de microtúbulos 18 .É posible que SPECC1L use un mecanismo similar para estabilizar outras proteínas como AKT.Demostrouse que a acetilación dos residuos de lisina na proteína AKT leva a unha diminución da localización da membrana e da fosforilación38.Ademais, é necesaria a ubiquitinación da cadea K63 no mesmo residuo de lisina en AKT para a súa localización e activación na membrana39,40.Entre varios factores que interactúan coas proteínas SPECC1L identificados en varias pantallas de dous híbridos de levadura de alto rendemento, catro - CCDC841, ECM2942, APC e UBE2I43 - estiveron implicados na rotación ou estabilidade das proteínas mediante a ubiquitinación ou a sumoilación.SPECC1L pode estar implicado na modificación postraducional dos residuos de lisina AKT, afectando a estabilidade da AKT.Non obstante, aínda está por dilucidar o papel crítico de SPECC1L na localización e estabilidade da proteína AKT.
Os defectos graves na expresión de SPECC1L in vivo provocaron un aumento da tinción do marcador AJ e unha superposición defectuosa de CNCC, así como un aumento da apoptose e da letalidade embrionaria precoz.Informes anteriores demostraron que os mutantes de rato con niveis aumentados de apoptose están asociados con defectos do tubo neural 44,45,46,47 e defectos craneofaciais48.Suxeriuse que a morte celular excesiva nos pregamentos neurais ou os arcos farínxeos pode producir un número insuficiente de células necesarias para o movemento morfoxenético adecuado 48,49,50.Pola contra, as nosas liñas celulares deficientes en SPECC1L cunha expresión de SPECC1L moderadamente reducida mostraron só cambios de AJ sen evidencia de aumento da morte celular.Non obstante, a inhibición química da vía PI3K-AKT nestas células Kd provocou un aumento da apoptose.Así, unha diminución moderada da expresión ou función de SPECC1L garante a supervivencia celular.Isto é consistente coa observación de que os raros embrións mutantes Specc11 que escapan da detención en st.E9.5, quizais debido á reducida eficiencia de captura de xenes, son capaces de pechar os seus tubos neurais e deterse máis tarde no seu desenvolvemento, a miúdo con defectos craneofaciais (Fig. S3).Tamén é consistente con isto a rara aparición de embrións heterocigotos Specc1l con anomalías craneofaciais, probablemente debido ao aumento da eficiencia de captura de xenes, así como o achado en peixe cebra no que un dos dous ortólogos SPECC1L (specc1lb) causa fenotipos embrionarios tardíos, incluída a perda de maxilares inferiores e fendas bilaterais51.Así, as mutacións heterocigotas con perda de función SPECC1L identificadas en pacientes humanos poden causar pequenos deterioros na función de SPECC1L durante a morfoxénese craneofacial, suficientes para explicar as súas fendas orofaciales.A regulación dos contactos intercelulares baseada en SPECC1L tamén pode desempeñar un papel na palatoxénese e na fusión dos arcos farínxeos.Estudos adicionais da función SPECC1L axudarán a dilucidar o papel dos contactos intercelulares temporais no CNCC durante o peche do tubo neural na motilidade das células neuroepiteliais e na morfoxénese craneofacial.
O control do osteosarcoma U2OS e as células SPECC1L-kd foron descritas anteriormente (Saadi et al., 2011).Os anticorpos contra SPECC1L tamén se caracterizaron previamente (Saadi et al., 2011).Anticorpos anti-β-catenina (coello; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (rato; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherina (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase escindida 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e β-actina (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) utilizouse como se describe..Os filamentos de actina tinguironse con faloidina de rodamina de tinción Acti (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Cultiváronse células de control U2OS e células SPECC1L-kd en DMEM estándar de alta glicosa complementado con soro bovino fetal ao 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Para os cambios de AJ, sementáronse 2 x 105 células en vidro tratado con xelatina porcina ao 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e observáronse cambios na forma celular.As células recolléronse en diferentes momentos indicados: 4 horas despois da sementeira (t = 1), 24 horas despois da sementeira (t = 2), confluencia sen cambios na forma celular (t = 3), cambio na forma celular (t = 4) , 24 h despois do cambio de forma celular (t = 5) e 48 h despois do cambio de forma celular (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Para modular a vía PI3K-AKT, cultivouse células nas concentracións indicadas co inhibidor de PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ou activador SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).O medio que contén os produtos químicos cambiouse diariamente.
Realizáronse gravacións cadro por cadro en células de control en directo e KD en condicións normais de cultivo, e recolléronse imaxes de contraste de fase cada 10 minutos durante 7 días.As imaxes foron adquiridas mediante un microscopio invertido Leica DM IRB controlado por ordenador equipado cunha plataforma mecánica e un obxectivo N-PLAN 10 × conectado a unha cámara QImaging Retiga-SRV.Durante a imaxe, os cultivos celulares mantivéronse a 37 °C nunha atmosfera húmida cun 5% de CO2.
Utilizáronse dúas liñas celulares ES de trampa xenética DTM096 e RRH048 do Centro de Recursos Rexional do Rato Mutante (UC Davis, CA) para xerar liñas de rato deficientes en Specc11, denominadas Specc1lgtDTM096 e Specc1lgtRRH046.Brevemente, inxectáronse células 129/REJ ES en blastocistos C57BL6.Os ratos machos quiméricos resultantes foron criados con ratos femias C57BL6 para identificar a descendencia coa coloración do pelaxe agouti.Utilizouse a presenza de insercións de vectores trampa xenética para identificar heterocigotos.Os ratos mantivéronse nun fondo mixto de 129/REJ; C57BL6.A localización do sitio de inserción do vector da trampa xenética foi confirmada mediante RT-PCR, secuenciación do xenoma e complementación xenética (figura complementaria 1).Para rastrexar a liñaxe CNCC de ratos Specc1lGT dobres heterocigotos, cruzáronse ratos ROSAmTmG (#007576) e Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) para producir o alelo ROSAmTmG e Wnt1-Cre no mutante Speccry1l.Todos os experimentos en ratos realizáronse segundo os protocolos aprobados polo Comité Institucional de Coidado e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Kansas.
Os embrións fixéronse en (1% de formaldehido, 0,2% de glutaraldehido, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP-40, 5 mM de EGTA) durante 60 min a temperatura ambiente.Despois da fixación en solución de tinción X-gal (ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, MgCl2 2 mM, desoxicolato sódico 0,01%, NP-40 0,02%, X-gal 1 mg/ml) O desenvolvemento da mancha realizouse a 37 °C. .°C en 1-6 horas.Os embrións fixéronse posteriormente nun 4% de PFA e visualizáronse.
Para a transferencia Western, as células foron lisadas en tampón de lise pasiva (Promega, Fitchburg, WI) complementada cunha mestura de inhibidores da protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Os lisados ​​foron procesados ​​en xeles preparados Mini-PROTEAN TGX de poliacrilamida ao 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidos a membranas de PVDF Immobilon (EMD Millipore, Billerica, MA).As membranas foron bloqueadas en leite ao 5% en PBS que contén 0,1% de Tween.Os anticorpos incubáronse durante a noite a 4 °C ou durante unha hora a temperatura ambiente.Utilizouse o reactivo Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) para a xeración de sinal.Para a inmunotinción, os embrións fixéronse durante a noite nun 4% de PFA/PBS e criopreservaron.As crioseccións de tecidos foron bloqueadas en PBS que contén 1% de soro de cabra normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) e 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e logo incubáronse a 4 °C nunha incubadora durante o noite.con anti-anticorpo e anticorpo secundario fluorescente (1:1000) durante 1 hora a 4 °C.Colocáronse seccións tinguidas en medio ProLong gold (Thermo Scientific, Waltham MA) e obtivéronse imaxes planas utilizando un microscopio confocal Leica TCS SPE.Cada inmunotinción realizouse como tres experimentos independentes en cirosseccións de polo menos dous embrións mutantes.Móstrase un experimento representativo.
As células foron incubadas en tampón RIPA modificado (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA e inhibidor da protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Brevemente, os lisados ​​foron prepurificados con perlas magnéticas de proteína G (Life Technologies, Carlsbad, CA) e logo incubáronse durante a noite a 4 °C. Utilizáronse esferas de proteína G anti-SPECC1L ou IgG para extraer SPECC1L e realizouse transferencia Western usando o anti-SPECC1L. Anticorpo -β-catenina descrito anteriormente Os experimentos co-IP mostrados son representativos de catro experimentos independentes.
Proporcionáronse células cultivadas fixas ou tecidos embrionarios de rato ao centro de microscopía electrónica do Centro Médico da Universidade de Kansas.Brevemente, as mostras foron incrustadas na resina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizáronse durante a noite a 60 °C e seccionáronse a 80 nm utilizando un ultramicrótomo Leica UC7 equipado cunha lámina de diamante.As seccións foron visualizadas mediante un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 equipado cunha pistola Lab6 de 100 kV.
Como citar este artigo: Wilson, NR et al.A deficiencia de SPECC1L leva a unha maior estabilidade das articulacións empalmadas e unha redución da delaminación das células da crista neural cranial.a ciencia.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indución e diferenciación da crista neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Células da crista neural craneal en movemento: o seu papel no desenvolvemento craneofacial.Revista Americana de Xenética Médica.Parte A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: o seu crecemento e desenvolvemento ao longo de 20 anos.Pediatra.patoloxía.laboratorio.medicina.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU e Noten MM Avance na xenética das fendas orofaciales.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. e Riley, FM Mecanismos moleculares da migración e patróns das células da crista neural cranial durante o desenvolvemento craneofacial.Desenvolvemento 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH e Murray, JK Labio leporino e padal: comprender as influencias xenéticas e ambientais.comentario natural.Xenética 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfoxénese anormal da pel, das extremidades e da rexión craneofacial en ratos con deficiencia de factor 6 regulador de interferón (Irf6).Genette Nacional.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.As mutacións dominantes en GRHL3 causan a síndrome de van der Waord e prexudican o desenvolvemento do peridermo oral.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ e Juriloff, DM Actualiza a lista de mutantes de rato con defectos no peche do tubo neural e avanza cara a unha comprensión xenética completa do peche do tubo neural.Investigación de defectos de nacemento.Parte A, Teratoloxía clínica e molecular 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. A sinalización PDGFRalpha mediada por PI3K regula a supervivencia e a proliferación no desenvolvemento do esqueleto a través dunha vía intracelular dependente de p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND e Murdoch, JN Disheveled: Relación da expansión converxente co peche do tubo neural.Tendencias en neuroloxía.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).