Compoñente químico de tubo enrolado de aceiro inoxidable 347, identificación de novas proteínas chaperonas do antíxeno leucocitario humano sensible ao interferón-A (HLA-A) mediante espectrometría de masas reticulada (CLMS)

Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Control deslizante que mostra tres artigos por diapositiva.Usa os botóns atrás e seguinte para moverte polas diapositivas ou os botóns do controlador de diapositivas ao final para moverte por cada diapositiva.

Descrición do produto

Tubos de bobina de aceiro inoxidable 347L, grao de aceiro: SS347L

O sistema de sinalización do interferón induce unha forte resposta de citocinas a unha ampla gama de sinais patóxenos e patolóxicos intrínsecos do medio ambiente, o que resulta na indución de subconxuntos de proteínas inducibles polo interferón.Aplicamos espectrometría de masas de enlace cruzado (CLMS) mediada por DSS para detectar novas interaccións proteína-proteína no dominio das proteínas inducidas por interferón.Ademais das esperadas proteínas inducibles por interferóns, tamén identificamos novos aductos cruzados intermoleculares e intramoleculares de proteínas canónicas inducibles por interferóns como MX1, USP18, OAS3 e STAT1.Centrámonos na validación ortogonal dun novo conxunto de redes de proteínas inducibles por interferón formadas por proteínas HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) mediante a co-inmunoprecipitación e o seu estudo posterior mediante modelado de dinámica molecular.O modelado da dinámica conformacional do complexo proteico revelou varios sitios de interacción que reflectían as interaccións identificadas nos achados do CLMS.Xuntos, presentamos un estudo piloto de CLMS para identificar novos complexos de sinalización inducidos polo interferón e esperamos un uso máis amplo de CLMS para identificar novas dinámicas de interaccións proteicas no microambiente tumoral.
Antes de que comece unha resposta inmune adaptativa, o sistema de defensa innato do hóspede monta unha resposta antimicrobiana mediada por unha familia de citocinas alfa-hélicoides secretadas chamadas interferóns (IFN).As clases de IFN tipo I IFNα e IFNβ activan respostas celulares, incluíndo estados antivirais, proapoptóticos, proinflamatorios e antiproliferativos.En humanos, coñécense 13 subtipos de IFNα, todos agrupados no cromosoma 91. Sorprendentemente, só se estudou IFNα2 para uso clínico.Recentemente, prestouse especial atención á investigación doutros subtipos de IFNα.Un estudo recente mostrou que o IFNα14 é unha das isoformas máis eficaces para restrinxir a replicación do HBV2 e do VIH-13,4 en comparación co subtipo canónico de IFNα2.
Estableceuse que os complexos de receptores de interferón tipo I activados (IFNAR1 e IFNAR2) desencadean unha fervenza de transdución de sinal mediada polas quinases Janus TYK2 e JAK15,6.Estas quinases Janus fosforilan transdutores de sinal e activadores de proteínas transcripcionais (STAT1 e STAT2) en residuos de tirosina para iniciar a heterodimerización mediada polo dominio SH26.Posteriormente, IRF9 únese aos heterodímeros STAT para formar un complexo trimérico do xene do factor 3 estimulado por IFN (ISGF3), que se trasládase ao núcleo e induce a transcrición de máis de 2000 xenes estimulados por interferón (ISG)5,6,7,8.
Os ISG forman a columna vertebral do sistema inmunitario innato, especialmente en resposta ao ataque viral.Como primeira liña de defensa contra a infección viral, as células despregan rapidamente interaccións extensas de proteínas celulares cunha ampla gama de actividades biolóxicas.Estas proteínas inclúen receptores de recoñecemento de patróns, moléculas de sinalización, factores de transcrición e proteínas con funcións antivirais directas, así como reguladores negativos das respostas inmunitarias9.Gran parte da información sobre a actividade de ISG provén de pantallas funcionais que utilizan pantallas de sobreexpresión10,11 ou técnicas de silenciamento de xenes (siRNA, RNAi e CRISPR)12,13 nas que se expresan ou inhiben os ISG individuais e a súa actividade é probada en varios virus.Aínda que estes estudos determinaron as propiedades antivirais dos ISG individuais, os mecanismos moleculares subxacentes de cada ISG seguen sendo moi descoñecidos.En xeral, acéptase que moitas proteínas interactúan cunha ou máis citocinas para garantir a súa actividade completa, polo que ou ben os ISG interactúan directamente ou as súas interaccións están mediadas por proteínas celulares.Por exemplo, un recente estudo de proteómica fotoreticulada identificou a ATPasa VCP/p97 como un dos principais compañeiros de interacción de IFITM3, cuxa inhibición leva a defectos na clasificación lisosomal, recambio e cotransporte de IFITM3 con partículas virais 14 .Usando a inmunoprecipitación, identificamos a VAPA, unha proteína asociada a vesículas, como un compañeiro de interacción con IFITM1/2/3 que media na maduración viral mediada polo colesterol, e isto foi confirmado por outro estudo que utilizou un sistema de dous híbridos de levadura.Apoio Científico 15 , 16 .
Un proceso biolóxico fundamental implicado na supresión da infección e na transformación maligna é a presentación do antíxeno, que está mediada por moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC).Os péptidos (de 8 a 12 aminoácidos de lonxitude) procedentes de proteínas escindidas, terminadas prematuramente ou mal pregadas cárganse no heterodímero MHC-I (constituído por cadeas pesadas e lixeiras de MHC-I, chamadas β-2-microglobulina; β2M) 17,18 .Os trímeros MHC-I estables resultantes son transportados á superficie celular, onde presentan péptidos intracelulares ás células T CD8+ (células T citotóxicas)17.As células T recoñecen e destrúen estes patóxenos e as células que levan un antíxeno específico do tumor.En consecuencia, os patóxenos e as células tumorais adoitan suprimir o proceso de presentación de antíxenos para evitar a vixilancia inmune.Ademais, o MHC-I está regulado á baixa no 40-90% dos tumores humanos e adoita asociarse cun peor prognóstico19.
Os xenes implicados na resposta aos patóxenos deben cambiar rapidamente entre un estado de repouso e un estado de transcrición activa.Polo tanto, hipótese que varias proteínas celulares están implicadas na resposta á alta demanda de IFN durante períodos curtos de tempo, incluíndo a remodelación e modificación da cromatina promotora 20,21.A maioría dos estudos centráronse na identificación de socios individuais de proteínas ISG en presenza de IFN.Varios estudos proteómicos e transcriptómicos en sistemas celulares modelo dilucidaron o efecto do IFN na paisaxe celular.Non obstante, a pesar da crecente comprensión da dinámica inducida polos interferóns, aínda sabemos pouco sobre a implicación dos ISG.Ao considerar a complexidade e a dinámica dependente do tempo da sinalización do interferón, xorden dúas preguntas: (i) é posible estabilizar e atrapar os complexos multiproteicos implicados na sinalización rápida e (ii) pódense mapear estas interaccións no espazo 3D?
Para abordar estes problemas, implementamos a reticulación química mediada por suberatos de disuccinimida (DSS) xunto coa espectrometría de masas (CLMS) para estudar a rede de interacción de proteínas inducidas por IFNα e a súa dinámica.O DSS engade enlaces covalentes entre residuos proximais de proteínas e/ou complexos proteicos in vivo.A análise posterior de MS revela sitios específicos de enlace cruzado que reflicten a proximidade espacial de rexións dentro dunha determinada proteína, chamadas enlaces internos, ou subunidades en complexos proteicos, chamadas interrelacións.Usando este enfoque, identificamos varios novos complexos proteína-proteína, así como redes de interacción multiproteína inducidas por interferón.Ao probar aínda máis un subconxunto destas novas interaccións, demostramos que H2BFS (FS de tipo histona H2B; en diante denominado H2B) e MDN1 actúan como socios de unión para HLA-A.
As células Flo-1 son un dos modelos in vitro máis coñecidos de adenocarcinoma esofágico xa que imitan as características fundamentais dos tumores esofágicos22,23.Non obstante, non todos os tumores son inmunoxénicos e para determinar se as células Flo-1 responden ao tratamento con interferón, tratamos as células Flo-1 con 10 ng/ml de IFNα durante 72 horas.As células Flo-1 mostraron unha indución precoz de pSTAT1 e IRF1, comezando 2 horas despois do tratamento e continuando durante 72 horas, cunha diminución dependente do tempo dos niveis estacionarios de IRF1 (Figura 1A).Os ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 e ISG15) foron fortemente inducidos despois de 6 horas, imitando as clásicas respostas de fase media e tardía ao IFNα (Figura 1A).Xuntos, estes datos suxiren que este modelo celular pode usarse para estudar as respostas do interferón.
Respostas de expresión de proteínas diferenciais en células Flo-1 despois do tratamento con IFNα.(A) Analizouse a expresión de proteínas en células Flo-1 tratadas con 10 ng/ml de IFNα durante 2, 6, 24, 48 e 72 horas mediante inmunotransferencia utilizando os anticorpos ISG indicados.(B) Xeles de SDS-PAGE tinguidos con azul de Coomassie de extractos de células enteiras despois da entrecruzamento con DSS durante os tempos e concentracións indicados.(C) Inmunotransferencia representativa examinada con anticorpo p53(DO-1) das mesmas mostras para avaliar o grao de entrecruzamento das proteínas.
Para capturar a paisaxe de interacción de proteínas in situ, utilizamos DSS, un axente de reticulación moi utilizado debido á súa alta permeabilidade da membrana e o seu tempo de reacción relativamente curto.O tempo de reacción máis curto axuda a evitar a formación de grandes agregados de proteínas reticuladas, mantendo así a estabilidade do reticulante.Para determinar a concentración óptima de DSS e evitar o exceso de reticulación, primeiro expuxemos as células a 5, 2,5 e 1 mM de DSS durante 5, 10, 5 e 30 minutos, respectivamente, e analizamos os lisados ​​mediante SDS-PAGE tinguidas con Coomassie. (datos non mostrados).Os lisados ​​celulares parecen estar altamente entrecruzados na concentración máis baixa e no momento máis curto.Polo tanto, o DSS valorouse a 1, 0,5 e 0,1 mM durante 5 minutos (Figura 1B).Observouse a reticulación óptima con DSS 0,5 mM durante 5 minutos, e estas condicións elixíronse para as células tratadas con IFNα.Ademais, a Figura 1C mostra unha transferencia Western realizada usando o anticorpo p53 (DO-1) para avaliar o grao de entrecruzamento das proteínas.
As células Flo-1 foron tratadas con 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas antes de engadir o reticulante.As células entrecruzadas foron posteriormente lisadas mediante proteólise en dous pasos e as proteínas foron procesadas por FASP (Fig. 2) 24, 25.Os péptidos trípticos entrecruzados foron analizados por espectrometría de masas (Fig. 2).Os espectros MS/MS son entón emparejados coa secuencia da proteína e cuantificados con MaxQuant26,27.Os péptidos entrecruzados foron identificados a partir dos espectros obtidos mediante o programa SIM-XL, e os compostos individuais combináronse nunha rede complexa mediante as canalizacións de software de computación de código aberto xQuest28 e SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifica as interaccións proteína-proteína, cadeas internas e cadeas individuais en mesturas de proteínas simples ou complexas e proporciona scripts para visualizar as interaccións nas estruturas proteicas.Ademais, clasifica cada referencia cruzada como unha puntuación de ID segundo a calidade do espectro MS/MS29.Identificáronse varias interaccións e complexos proteína-proteína altamente fiables, e un novo conxunto de interaccións investigouse aínda máis mediante a co-inmunoprecipitación e os cambios conformacionais dos complexos mediante o modelado de dinámica molecular (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Visión esquemática do método CLMS.As células Flo-1 foron tratadas con 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas, seguido de entrecruzamento de proteínas in situ mediante DSS seguido de lise celular e tripsinización.As mostras entrecruzadas foron analizadas mediante un espectrómetro de masas Orbitrap e posteriormente mostráronse para a fragmentación dos precursores peptídicos durante a LC-MS/MS.Identificáronse dous péptidos ligados a partir dos espectros obtidos mediante a máquina de recoñecemento de espectros do programa de péptidos reticulados (SIM-XL) e todos os compostos combináronse nunha rede complexa mediante canalizacións computacionais.Filtra as interaccións de baixa confianza en función das puntuacións de índices de falsos positivos (FDR).Varias novas interaccións proteína-proteína de alta fidelidade confirmáronse aínda máis mediante a co-inmunoprecipitación e examináronse os cambios conformacionais nos complexos mediante o modelado de dinámica molecular (MD).
Un total de ~ 30.500 e ~ 28.500 péptidos detectáronse usando MaxQuant en mostras de IFNα non estimuladas e estimuladas, respectivamente (Táboa complementaria S1, figura 3A).A distribución da lonxitude do péptido en ambos os casos mostrou unha maior proporción de péptidos máis grandes, o que indica a presenza de péptidos entrecruzados (Fig. 3B, C).Ademais, unha proporción maior de péptidos máis grandes estaban presentes no rango 40-55 en mostras tratadas con IFNα (Fig. 3C).A cartografía de proteínas contra a intensidade log2 mostrou que as proteínas clásicas estimuladas con interferón eran as máis abundantes en comparación coas mostras non tratadas, incluíndo MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 e HLA-F (Figura 3D).A análise das vías de proteínas enriquecidas máis de tres veces en resposta ao tratamento con IFNα mediante a base de datos da vía Reactome mostrou que a presentación e procesamento do antíxeno mediado por MHC-I era a vía máis dominante (Figura 3E).En consonancia con informes anteriores, as respostas antivirais mediadas pola OEA e ISG15, así como a sinalización de IFNα/β e citocinas estaban entre as vías activadas.Ademais, identificáronse enlaces cruzados de proteínas específicas de lisina e serina a partir dos espectros MS/MS adquiridos orixinalmente mediante SIM-XL.Un estudo recente informou de 104 ISG que abarcan 20 virus de 9 clases de virus mediante a metaanálise de estudos de sobreexpresión de ISG individuais en 5 tipos de células9.Non obstante, para superar as limitacións computacionais da selección de grandes conxuntos de datos, comezamos cun conxunto de datos máis pequeno para explorar as posibles interaccións entre a lista de xenes IRDS informados por Padaria et al., a maioría dos cales son ISG.
Identificación de proteínas entrecruzadas expresadas de forma diferencial en resposta a IFNα (datos obtidos de MaxQuant).(A) Diagrama de Venn que representa o número de péptidos comúns e exclusivos identificados en mostras de Flo-1 tratadas e non tratadas con IFNα14.Distribución da lonxitude do péptido das mostras reticuladas non tratadas (B) e tratadas con IFNα (C).(D) Mapa de calor que representa log2 (intensidade LFQ) entre células Flo-1 non tratadas e tratadas con IFNα14.O panel esquerdo mostra as proteínas máis activamente activadas en presenza de IFNα.(E) Histograma que representa as 20 principais vías de enriquecemento despois do tratamento con IFNα.A base de datos da vía Reactome analizou máis de catro veces os cambios nas proteínas que responden a IFNα.
A estimulación de ISG mediada por interferóns está ben documentada, pero a nivel molecular non se entende pouco como estas proteínas culminan nunha ampla gama de funcións biolóxicas.Investigamos as interaccións proteicas cun alto grao de confianza entre os ISG coñecidos.Curiosamente, identificamos unha rede que inclúe proteínas MX1, USP18, ROBO1, OAS3 e STAT1 que forman un gran complexo en resposta ao tratamento con IFNα (Figura 4, Táboa S2) 32,33,34.O máis importante é que estas interaccións atopáronse en todos os triplicados tratados con IFNα e non se atoparon en mostras non tratadas, o que suxire que se formaron especificamente en resposta ao tratamento con IFNα.Sábese que STAT1 regula transcripcionalmente a expresión destes ISG, pero non se estudou a súa interacción cos ISG a nivel proteico.A estrutura cristalina de STAT1 mostrou que o seu dominio helicoidal (CCD) non está implicado na interacción co ADN ou os protómeros durante a formación dos dímeros35.Estas hélices α forman unha estrutura de hélice helicoidal que proporciona unha superficie predominantemente hidrófila para que se produzan interaccións 35 .Nos nosos datos CLMS, observamos que a maioría das interaccións con STAT1 ocorreron no dominio SH2 que precede ao CCD, o dominio do enlace ou a cola C-terminal (residuos 700-708) (Figura 4A).Un estudo anterior informou de que a USP18 únese ao dominio de unión ao CCD e ao ADN (DBD) de STAT2 e é recrutada na subunidade do receptor de interferón tipo I IFNAR2 para mediar a inhibición da sinalización do interferón tipo I 24 .Os nosos datos tamén mostraron que o dominio catalítico USP18 interactúa con STAT1 DBD (Figura 4A, D), o que suxire que tanto STAT1 como STAT2 poden desempeñar un papel na atracción de USP18 a IFNAR2.
Rede ISG proteína-proteína identificada en células entrecruzadas tratadas con IFNα.(A) Gráfico de interacción 2D que mostra as interaccións proteína-proteína (xeradas no programa SIM-XL), con liñas que representan interaccións intermoleculares (corte de enlace cruzado establecido en 3,5).Os dominios de diferentes identidades están marcados pola súa cor32: dominio MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) e GED (569–660).Dominios OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) e OAS1_C (903-108).Dominio ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) e fn3 (777–864).Campos STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) e STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Visor circular de proteínas entrecruzadas (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 e STAT1) con interaccións e interaccións marcadas en azul e vermello, respectivamente.O limiar de enlace cruzado estableceuse en 3,5.Os gráficos de puntos indican sitios de interacción STAT1 con MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) e OAS3 (F), así como sitios de interacción K ou S entre os dous péptidos.Na figura, o limiar de puntuación de enlace cruzado establécese en 3,0.(G) Varios sitios de interacción entre os dominios DI STAT1 e OAS3 superpostos ás súas estruturas proteicas en PyMol (sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) e OAS3 (id pdb: 4s3n34).) programa.
Describíronse dúas isoformas de USP18 en humanos, unha proteína de lonxitude completa que se localiza predominantemente no núcleo, e unha isoforma sen dominio N-terminal, USP18-sf, que se distribúe uniformemente no citoplasma e no núcleo 36 .Ademais, previuse que o extremo N-terminal non está estruturado e non require actividade isopeptidase nin unión a ISG1537.A maioría das interaccións identificadas no noso estudo localizáronse no extremo N-terminal da proteína, o que suxire que estas interaccións implican a USP18 de lonxitude total (Figura 4A, D) e, polo tanto, é probable que se produzan no núcleo.Ademais, os nosos datos tamén indican que o N-terminal está especializado para interaccións proteína-proteína.O sitio de unión de IFNAR2 está situado entre os residuos 312-368 e, en particular, ningunha das proteínas do complexo se une a esta rexión (Fig. 4A) 37,38.Estes datos en conxunto indican que o dominio de unión a IFNAR2 é usado exclusivamente pola proteína receptora.Ademais, só se atopou que OAS3 e ROBO1 estaban asociados con dominios augas arriba do N-terminal e do sitio de unión de IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 pertence á superfamilia de inmunoglobulinas (Ig) de moléculas de sinalización transmembrana e consta de cinco dominios Ig e tres dominios de fibronectina (Fn) na rexión extracelular.Estes dominios extracelulares van seguidos dunha rexión proximal da membrana e dunha única hélice transmembrana 39. Unha rexión intracelular non estruturada está situada no extremo C-terminal e contén motivos de secuencia conservados que median a unión á proteína efectora39.A rexión que se estende desde os aminoácidos ~1100 ata 1600 está maiormente desordenada.Descubrimos que MX1 interactúa con ROBO1 a través de Ig, Fn e dominios intracelulares, mentres que a maioría das interaccións con STAT1 ocorren entre o seu CCD, o dominio do enlace e o C-terminal de ROBO1 (Fig. 4A, E).Por outra banda, as interaccións coas rexións ligadoras DI, DIII e OAS3 distribuíronse por toda a proteína ROBO1 (Fig. 4A).
A familia de proteínas da oligoadenilato sintase (OAS) acepta e únese ao ARN bicatenario intracelular (ARNdc), sofre cambios conformacionais e sintetiza oligoadenilatos ligados a 2′,5′ (2-5 As) 40 .Descubriuse que entre os tres OAS, OAS3 presenta a maior afinidade polo ARNdb e sintetiza a menor cantidade de 2-5 As, que poden activar a RNase L e limitar así a replicación viral 41 .A familia OAS está formada por dominios de nucleótidos transferase tipo polimerase beta (pol-β).Investigacións anteriores demostraron que a actividade catalítica do dominio C-terminal (DIII) depende do dominio de unión ao ARNds (DI), que é necesario para a activación de OAS342.Observamos que os dominios DI e DII de OAS3 interactúan con CCD e unha pequena rexión de unión entre SH2 e STAT1 TAD (Figura 4A, F).A superposición de diferentes sitios de reticulación na estrutura da proteína revelou unha interacción entre a folla β e o bucle STAT1 DBD e un peto ou cavidade aberta formada por residuos 60-75 no dominio DI de OAS3 (Fig. 4G).A orientación das proteínas no complexo tamén indicou que ningunha das interaccións con OAS3 interferiu coa capacidade de unión ao ADN do seu dominio DI (Fig. S1A).Ademais, o dominio N-terminal da GTPase MX1 interactúa amplamente cos dominios DI e DIII de OAS3 (Fig. 4A).Tamén observamos unha interacción entre OAS1 e MX1 nas tres repeticións tratadas con IFNα, onde un único dominio OAS1 (tamén catalíticamente activo) interactuou cos tres dominios MX1 (Figura S2A, B).
As proteínas MX forman parte dunha gran familia de GTPases similares á dineína que conteñen un dominio GTPasa N-terminal que se une e hidroliza a GTP, un dominio intermedio que media na autoensamblaxe e unha cremalleira de leucina C-terminal que actúa como GTPase (LZ). ).dominio efector dominio25,43.MX1 únese a subunidades das polimerases virais para bloquear a transcrición do xene viral43.Unha pantalla de dous híbridos de levadura previamente informada mostrou que o MX1 asociado a PIAS1 inhibe a activación do xene mediada por STAT1 ao bloquear a actividade de unión ao ADN e tamén ten actividade da ligase SUMO E344,45.Aquí, demostramos que MX1 únese a STAT1 (Figura 4C, D), pero como esta interacción afecta á activación do xene mediada por STAT1 en resposta a IFNα necesita máis estudo.Ademais, tamén descubrimos que MX1 interactuou con IFIT3 e DDX60 nas tres repeticións tratadas con IFNα (Fig. S2C).
A DDX60 é unha helicase citoplasmática inducida por IFN que se informou anteriormente de desempeñar un papel na degradación independente de RIG-I do ARN46 viral.Interacciona co RIG-I e activa a súa sinalización dun xeito específico de ligando 46. DDX60 consta dun dominio helicase DEXD/H-Box e un dominio helicase C-terminal que se unen ao ARN e ao ADN viral47.A maioría das súas interaccións con MX1 e IFIT3 ocorren dentro de longas rexións N e C-terminais sen dominios ou motivos canónicos (Fig. S2E, F).Non obstante, MX1 tamén está asociado co dominio helicase DEXD/H-Box (Fig. S2E).As proteínas da familia IFIT teñen copias en tándem dun motivo distintivo de hélice-xiro-hélice chamado repetición tetrapéptida (TPR).Atopouse que IFIT3 era un modulador positivo da sinalización RIG-I e, polo tanto, un compoñente do complexo MAVS.En conxunto, os nosos datos suxiren que IFIT3 e DDX60 interactúan principalmente na rexión entre TPR 3-6 de IFIT3 e poden desempeñar un papel na sinalización RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Dado que o cribado de todo o proteoma é computacionalmente intensivo, entón analizamos toda a base de datos UniProt humana para detectar a presenza dunha das repeticións tratadas con IFNα.Nesta réplica, atopamos varias redes de interacción altamente fiables para HLA-A.A análise das vías proteicas identificadas polos espectros MS/MS mostrou que o procesamento e presentación do antíxeno baseado en MHC-I é a principal vía inducida polo interferón (Fig. 3D).Polo tanto, centrámonos en estudar as interaccións proteicas das moléculas de MHC-I cun alto grao de confianza en todas as mostras entrecruzadas.O HLA está formado por dominios α1, α2 e α3 e cadeas lixeiras, e a microglobulina β2 (β2m) é unha proteína chaperona constante49.Unha vez ensamblado no retículo endoplasmático, o HLA é inestable en ausencia de ligandos peptídicos50.O suco de unión ao péptido está formado polos dominios α1 e α2 altamente polimórficos e non estruturados en forma non peptídica e o dominio α351 relativamente menos polimórfico.En presenza de IFNα, detectamos dous complexos HLA-A: un interactúa con HMGA1 e H2B (Figura 5, Táboa S3) e o outro interactúa con MDN1, LRCH4 e H2B (Figura 6).
IFNα induce unha rede de interacción HLA-A con H2B (H2BFS) e HMGA1.(A) Gráfico 2D (xerado no software SIM-XL) que representa diferentes tipos de interaccións no complexo H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (azul), interlink (vermello) e single link (negro)..Os dominios de diferentes identidades están codificados por cores32: H2B (histona; 2–102) e MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364).O limiar de enlace cruzado estableceuse en 3,5.Os gráficos de puntos indican sitios de interacción HLA-A con H2B (B) e HMGA1 (C), así como sitios de interacción K ou S entre os dous péptidos.Na figura, o limiar de puntuación de enlace cruzado establécese en 3,0.(D) Relacións entre proteínas mostradas nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1 no programa PyMOL.Estas estruturas foron modeladas usando o servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) e as estruturas modelo para as proteínas H2B, HLA-A e HMGA1 foron 1kx552, 1kj349 e 2eze55, respectivamente.
IFNα induce unha rede de interacción HLA-A con H2B (H2BFS), MDN1 e LRCH4.(A) Enlaces cruzados intramoleculares (vermello) e intermoleculares (azul) presentados nun mapa interactivo 2D (xerado no software SIM-XL) con MDN1 representado como un círculo.O limiar de enlace cruzado estableceuse en 3,5.Os dominios de diferentes identidades están codificados por cores32: H2B (histona; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364) e LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) e CH (535–641)).(B) Relacións entre proteínas mostradas nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1 no programa PyMOL.Estas estruturas modeláronse usando o servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) con estruturas modelo 1kx552, 1kj349, 6hlu62 e 6i2665 para as proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1, respectivamente.Gráficas de puntos que mostran sitios de interacción K ou S para HLA-A con H2B (C), LRCH4 (D) e MDN1 (E).Para os gráficos, o limiar de puntuación de enlace cruzado estableceuse en 3,0.
Ademais de manter a integridade do xenoma, a histona H2B tamén está implicada na regulación da transcrición.A proteína H2B consiste nun dominio histona central (HFD) formado por tres hélices α separadas por bucles e unha cola C-terminal 41,52.A maior parte da interacción co H2B ocorre na hélice α1, que proporciona a trimerización co heterodímero HFD (Fig. 5A,B).Aínda que as lisinas están implicadas na unión ao ADN, algunhas lisinas tamén son sitios alternativos de acetilación ou metilación.Por exemplo, os residuos K43, K46 e K57 de H2B non están implicados na unión directa ao ADN, pero son obxectivos de varias modificacións post-transcrición53.Do mesmo xeito, os residuos K44, K47 e K57 en H2B poden desempeñar un papel alternativo na presenza de IFNα, incluíndo as interaccións con outras proteínas (Fig. 5A, B).Ademais, a histona extracromosómica H2B activa a resposta inmune en varios tipos celulares, actuando como sensor citosólico para detectar fragmentos de ADN bicatenario (dsDNA) derivados de axentes infecciosos ou células danadas54.En presenza de virus de ADN, o esgotamento de H2B inhibiu a produción de IFN-β e a fosforilación de STAT154.Tamén se sabe que o H2B entra e sae do núcleo máis rápido que outras histonas do núcleo54.Tamén se observaron interaccións H2B con MDN1 e LRCH4 en mostras seleccionadas sen tratar.Descubrimos que HLA-A interactuou con H2B nas tres mostras tratadas con IFNα e nunha mostra repetida non tratada.Estes datos reflicten o papel do H2B nunha función fisiolóxica alternativa independente da regulación transcripcional.
HMGA1 (grupo de alta mobilidade AT-Hook 1), unha pequena nucleoproteína rica en aminoácidos promotores de enfermidades, identificouse en asociación con HLA-A.Ten unha cola C-terminal ácida e tres DBD distintos chamados ganchos AT porque se unen ao suco menor da rexión rica en AT do ADNds55,56.Esta unión fai que o ADN se doble ou se endereite, permitindo que os factores de transcrición canónicos accedan á súa secuencia consenso.Crese que a cola C-terminal está implicada nas interaccións proteína-proteína e no recrutamento de factores de transcrición, xa que os mutantes de deleción C-terminal non son capaces de iniciar a transcrición57.Ademais, este dominio contén varios sitios de fosforilación conservados que son substratos coñecidos para quinases 58 .Observamos interaccións HLA-A e H2B con HMGA1 fóra do dominio C-terminal, o que suxire que o dominio C-terminal se usa principalmente para a unión do factor de transcrición (Fig. 5A, C).As proteínas HMGA compiten coa histona H1 para unirse ao ADN do adaptador, aumentando así a accesibilidade57.Do mesmo xeito, parece probable que o HMGA interaccione coa histona H2B ao longo do ADN enlazador en competencia coa histona H1.HMGB1 induce a expresión de HLA-A, -B e -C nas células dendríticas, o que leva á súa activación59, pero non se informou previamente dunha interacción entre HMG e HLA.Descubrimos que HMGA1 interactúa cos dominios α1 e α3 de HLA-A, coa maioría das interaccións fóra do seu 3 DBD (Figura 5A, C).Nas nosas mans, descubriuse que o HLA-A estaba localizado no núcleo (datos non mostrados) e dado que H2B e HMGA1 tamén están presentes no núcleo, esta interacción probablemente ocorre no núcleo.Os aductos específicos medidos entre H2B, HLA-A e HMGA1 móstranse na figura 5D.
A maioría das interaccións do HLA-A con outras proteínas ocorren dentro dos seus dominios α1 e α2 e do dominio C-terminal desordenado (Fig. 6).Nun destes exemplos, descubrimos que HLA-A interactúa coa cola N-terminal desordenada de LRCH4 (Figura 6A, D).LRCH4 regula a activación de TLR4 e a indución de citocinas LPS, modulando así a resposta inmune innata60,61.É unha proteína de membrana con nove repeticións ricas en leucina (LRR) e un motivo de homoloxía en calmodulina (CH) no seu ectodominio, seguido dun dominio transmembrana (TMD) 60 , 62 .Informes que os dominios CH median as interaccións proteína-proteína 60 .Un tramo duns 300 aminoácidos entre os dominios LRR e CH é relativamente accesible pero desordenado.Baseándonos na función das rexións desordenadas como mediadoras das redes proteína-proteína e do transporte vesicular 63 , descubrimos que a maioría das interaccións proteicas ocorren en rexións desordenadas.As interaccións con MDN1 distribuíronse ao longo da lonxitude da proteína, incluíndo os dominios LRR1, LRR6, CH e rexións aleatorias, mentres que o H2B uníase principalmente ao dominio CH (Fig. 6A, B).En particular, ningunha das interaccións incluíu a ATM, o que suxire a especificidade do enfoque CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 tamén se identificou como parte da rede de proteínas HLA-A (Figura 6A).Pertence á familia de proteínas AAA (ATPases asociadas a diferentes actividades).Este é o mesmo dominio AAA N-terminal que se organiza nun anel hexamérico e elimina o factor de ensamblaxe da subunidade ribosómica 60S 64.parece ser semellante á dineína64,65,66.Ademais, a rexión rica en Asp/Glu é seguida do dominio MIDAS (sitio dependente de ións metálicos).Debido ao gran tamaño de MDN1 (aproximadamente 5600 aminoácidos) e á súa homoloxía limitada con proteínas ben estudadas, pouco se sabe sobre a súa estrutura e función en humanos.Identificamos HLA-A, H2B e LRCH4 como socios de unión a MDN1 e revelamos a súa orientación como complexos proteicos en PyMol (Fig. 6A, B).Estas tres proteínas interactúan co dominio AAA, co dominio enlazante tipo dineína e posiblemente co dominio MIDAS MDN1.Nun informe anterior, a purificación por afinidade das proteínas do cebo identificou a MDN1 como unha proteína asociada á histona H2B67.Ademais, un estudo recente tamén informou dunha interacción entre MDN e HLA-B en células HCT116 mediante espectrometría de masas purificada por afinidade, apoiando os nosos descubrimentos68.A identificación deste complexo en mostras tratadas con IFNα suxire un papel de MDN1 na sinalización do interferón.
Debido a que os xenes HLA son altamente polimórficos, extraemos lecturas de secuenciación que mapeaban HLA-A, -B e -C dos datos de secuenciación de ARN das células Flo-1 (datos non mostrados).As secuencias peptídicas consistentes coa lectura de secuenciación revelaron diferenzas significativas entre HLA-A, -B e -C nas rexións onde se localizaron os péptidos entrecruzados no HLA-A (Figura S3).Ademais, non observamos o enlace cruzado proteína-proteína das moléculas HLA-B/C coas proteínas H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Isto suxire que a interacción proteica atopada entre HLA-A, MDN1, LRCH1 e HMGA1 é específica de HLA-A.Ademais, a análise proteómica de mostras non entrecruzadas (táboa S4) mostrou que o HLA-A ten unha maior cobertura de secuencias en comparación co HLA-B ou HLA-C.Os péptidos identificados para o HLA-A tiñan unha intensidade elevada tanto en mostras tratadas con IFNα como en mostras non tratadas.
Para asegurarnos de que as interaccións identificadas aquí non se deban á unión cruzada inespecífica de dúas proteínas en estreita proximidade espacial, confirmamos ademais dous novos factores de interacción HLA-A mediante a realización de ensaios de co-inmunoprecipitación.As interaccións HLA-A con MDN1 e H2B endóxenos detectáronse tanto nas células Flo-1 tratadas con IFNα como nas non tratadas (Figura 7, Figura S4).Confirmamos que o HLA-A foi capturado por H2B nos inmunoprecipitados e que esta asociación se debeu ao tratamento con IFNα xa que o HLA-A estaba ausente nas mostras de inmunoprecipitados de células non tratadas (Figura 7A).Non obstante, os nosos datos suxiren que o IFNα regula de forma diferenciada a unión de HLA-A a H2B e MDN1.O IFNα induce a asociación entre H2B e HLA-A, pero reduce a súa asociación con MDN1.Descubrimos que MDN1 estaba asociado con HLA-A nos controis, e a adición de IFNα reduciu esta interacción independentemente da indución de MDN1 por IFNα (Figura 7B, C).Ademais, a inmunoprecipitación de HLA-A capturou H2B nas células A549 (Fig. S4), o que suxire que esta interacción é independente do tipo celular.En conxunto, estes resultados apoian as interaccións mediadas por interferóns de HLA-A con H2B e MDN1.
HLA-A co-purifica H2B e MDN1.Os inmunoblots H2B (A) e MDN1 (B) endóxenos representativos foron inmunoprecipitados a partir de células Flo-1 tratadas con IFNα e sondáronse para detectar os anticorpos indicados.Utilizáronse IgG de rato e coello como control negativo.(C) As cantidades relativas (entrada) de diferentes antíxenos represéntanse mediante inmunotransferencias probadas contra os anticorpos indicados, utilizouse a β-actina como control de carga.
Investigáronse as propiedades estruturais dunha das redes entrecruzadas altamente fiables inducidas polo interferón, H2B-HLA-A-HMGA1.Utilizamos o modelado de dinámica molecular como unha aproximación alternativa para comprender a dinámica conformacional das proteínas implicadas neste complexo (Figura 8).As inferencias dos datos do CLMS suxiren a posibilidade de diferentes conformacións das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1.Polo tanto, modeláronse os seguintes complexos potenciais nun medio disolvente: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.Unha pantalla de acoplamento proteína-proteína inicial usando o paquete MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá) suxeriu posibles conformacións que difiren entre estas proteínas (Fig. 8A).A visualización do complexo de proteínas de atraque revelou varias interaccións e posibles conformacións (Figura 5A, 8).Así, unha posible conformación móstrase na Figura 8A (con enlaces cruzados etiquetados) e avaliouse aínda máis mediante a canalización de modelado MD.Ademais, a unión de H2B ou HMGA1 a HLA-A destaca a maior afinidade de H2B por HLA-A (Fig. 8A).
Dinámica conformacional de posibles redes entre os complexos H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.(A) O panel esquerdo é un mapa 2D (xerado no software SIM-XL) de enlaces cruzados intramoleculares (vermello) e intermoleculares (azul) (corte de enlace cruzado establecido en 3,5).Ademais, os residuos de entrecruzamento identificados están marcados nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1.As conformacións asociadas destas proteínas foron extraídas mediante o docking pipeline implementado no paquete MOE.O panel inferior esquerdo mostra as diversas conformacións posibles dos complexos H2B-HLA-A e HMGA1-HLA-A con diferentes afinidades de unión proteína-proteína (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Desviación estándar (RMSD) das posicións atómicas (excluíndo os átomos de hidróxeno) para cada estrutura proteica.(C) Interaccións de enlaces de hidróxeno proteína-proteína intermoleculares de varios complexos simulados considerando interaccións específicas de duración ≥ 10 ns.A distancia de corte do doador-aceptor do enlace h estableceuse en 3,5 Å e o ángulo de corte do doador-aceptor H en ≥ 160°–180°.(D) Residuos marcados que forman interaccións proteína-proteína HLA-A cos seus respectivos compañeiros, que abarcan ≥ 20 ns, extraídos de complexos HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1 ficticios.As estruturas proteicas representan unha estrutura media de 100 ns MDS.(E) Interaccións entre os complexos HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1 en comparación coas interaccións seguidas pola simulación H2B-HLA durante 100 ns en función do sitio de interacción K ou S entre os dous péptidos.Complexos /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.O valor límite para a avaliación dos enlaces cruzados estableceuse en 3,0 e tivéronse en conta as interaccións específicas de MDS que tomaban ≥ 10 ns.As estruturas das proteínas foron visualizadas mediante paquetes BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, EUA) e Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
A estabilidade das moléculas de HLA-A ao longo do tempo (desviación estándar; RMSD ou desviación estándar; RMSF) indicou que a presenza de proteínas H2B ou HMGA1 nos complexos estabilizou o HLA-A (Figura 8B, Figura S5).A proteína HMGA1 únese fortemente ao sitio B2M de HLA-A, inducindo a estabilidade dos aminoácidos HLA-A no complexo HLA-A-HMGA1 ou H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).en particular, os residuos de HLA ~60-90 e ~180-210 foron menos flexibles en presenza de H2B (FIGURA 8B).H2B e HMGA1 mostraron unha mellor unión a HLA-A no complexo H2B-HLA-A-HMGA1 en comparación coa unión HLA-A a H2B ou HMGA1 só (Figura 8C, D; Táboa S5).Os residuos implicados nos enlaces de hidróxeno (modelo MD de alta ocupación ≥ 10 ns) coinciden cos sitios de interacción CLMS (residuos K ou S) no complexo, o que suxire que as interaccións identificadas por CLMS son moi fiables.Fiabilidade (Fig. 8E).No modelado CLMS e MD, os residuos de HLA-A entre uns 190-210 e uns 200-220 aminoácidos se unían a H2B e HMGA1, respectivamente (Figura 8E).
As interaccións proteína-proteína forman redes estruturais dinámicas que median a comunicación intracelular en resposta a certos estímulos.Dado que moitas aproximacións proteómicas detectan cambios no nivel global de estado estacionario dunha proteína, a dinámica de interacción proteína-proteína require ferramentas adicionais para capturar interfaces de unión, e CLMS é unha desas ferramentas.O sistema de sinalización de interferóns é unha rede de citocinas que permite ás células responder a unha serie de sinais patóxenos e patolóxicos intrínsecos ambientais, que culminan na indución de subconxuntos de proteínas inducibles polo interferón.Aplicamos CLMS para determinar se se poderían identificar novas interaccións proteína-proteína entre un panel de proteínas inducidas por interferón.Utilizouse a análise global de entrecruzamento de proteínas nun modelo de células Flo-1 sensibles ao interferón para capturar complexos proteicos.A extracción de péptidos trípticos de células non entrecruzadas e entrecruzadas permite o reconto de péptidos, o enriquecemento da vía e a distribución da lonxitude do péptido cunha intensidade de LFQ definida.Identificáronse as proteínas canónicas inducibles por interferóns como un control interno positivo, mentres que se observaron novos aductos intermoleculares e intramoleculares entrecruzados de proteínas canónicas inducibles por interferóns como MX1, UP18, OAS3 e STAT1.Investigáronse varias características estruturais e interaccións en áreas funcionais.
Detectouse unha interacción entre HLA-A, MDN1 e H2B mediante inmunotransferencia en células Flo-1 e A549 tratadas e non tratadas con IFNα.Os nosos resultados destacan que o HLA-A se complexa con H2B dun xeito dependente de IFNα.O noso traballo representa unha vía interesante para a exploración da co-localización destes dous complexos.Tamén sería interesante ampliar o enfoque CLMS a un panel de liñas celulares para identificar interaccións proteicas mediadas por interferóns independentes do tipo celular.Finalmente, utilizamos o modelado MD como un enfoque alternativo para comprender a dinámica conformacional das proteínas implicadas no complexo H2BFS-HLA-A-HMGA1, que rastrexaba as conversacións cruzadas intramoleculares e intermoleculares.As inferencias dos datos do CLMS suxiren a posibilidade de diferentes conformacións das proteínas H2BFS, HLA-A e HMGA1.As posibles diferentes conformacións entre estes complexos de proteínas de atraque revelaron varias interaccións similares ás observadas no conxunto de datos CLMS.Un dos principais puntos fortes do noso método é que permite a identificación sinxela de xenes altamente polimórficos en interacción como o HLA, polo que será interesante estudar as interaccións de proteínas específicas do haplotipo HLA que doutro xeito son difíciles de estudar.En conxunto, os nosos datos demostran que CLMS pode usarse para ampliar a nosa comprensión das redes de sinalización inducidas por interferóns e proporcionar unha base para estudar sistemas intercelulares máis complexos no microambiente do tumor.
As células Flo-1 obtivéronse de ATCC e mantivéronse en DMEM (Gibco) complementadas con 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen), 10% de soro fetal bovino (Gibco) e almacenáronse a 37 °C e 5% de CO2.Incubación.As células creceron ata un 70-80% de confluencia antes de ser tratadas con IFNα14 (fabricado pola Edinburgh Protein Production Facility).Todos os outros produtos químicos e reactivos foron adquiridos de Sigma Aldrich a non ser que se indique o contrario.
Cultiváronse as células Flo-1 en placas de 6 pocillos e ao día seguinte as células foron tratadas con 10 ng/ml de IFNα14 durante 24 horas ata unha confluencia de aproximadamente o 80%.As células laváronse tres veces con PBS e ligáronse con DSS (Thermo Fisher Scientific) recentemente preparado (disolto en DMSO) en PBS durante 5 min a 37 °C ata unha concentración final de 0,5 mM.A reacción de reticulación DSS substituíuse por PBS e o DSS residual extinguiuse engadindo 20 mM de Tris (pH 8,0) en PBS durante 15 min a 37 °C.As células recolléronse por raspado e recolléronse en tubos de baixa unión (Axygen).
O sedimento celular foi lisado con 300 µl de tampón de lise de urea (urea 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) durante 30 min a temperatura ambiente con axitación ocasional.Todos os pasos de centrifugación realizáronse a 14.000 xg a 8 °C.Centrifugar o lisado durante 10 minutos e transferir o sobrenadante a un novo tubo.As partículas claras restantes disolvéronse en 150 μl do segundo tampón de lise (urea 2 M, SDS ao 2% (p/v) (dodecilsulfato de sodio)) durante 30 minutos ou máis ata obter unha solución acuosa homoxénea.O lisado centrifugouse durante 20 minutos e o sobrenadante mesturouse co lisado obtido no paso anterior.As concentracións de proteínas avaliáronse mediante o ensaio Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) segundo as instrucións do fabricante para os procedementos de microplacas.As mostras conxeláronse rapidamente en nitróxeno líquido e almacenáronse a -80 °C.
Aproximadamente 100 μg de proteína reticulada soluble foron procesados ​​mediante un protocolo de preparación de mostras de filtración modificado (FASP) segundo o descrito por Wisniewski et al.69 Brevemente, a proteína reticulárase con 200 µl de tampón de urea (urea 8 M en Tris 0,1 M, pH 8,5), vórtexase e divídese á metade.Todos os pasos de centrifugación realizáronse a 14.000 xg a 25 °C.A primeira metade do lisado de proteínas reticulada foi transferida a un dispositivo de filtro centrífugo Microcon de 10 kDa equipado cunha membrana Ultracel-10 (Merck), seguido de centrifugación no filtro durante 25 minutos.A continuación, engade a segunda metade da proteína ao filtro e repita os mesmos pasos.A recuperación das proteínas realizouse engadindo 100 μl de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 17 mM en tampón de urea.A recuperación foi axitada nun termomezclador a 600 rpm durante 30 min a 37 °C.Ademais, centrifugouse a columna e alquilouse a proteína reticulada reducida usando 100 μl de iodoacetamida 50 mM en tampón de urea.A reacción de alquilación levouse a cabo a temperatura ambiente durante 20 minutos na escuridade.Xire a columna, lave as paredes da columna 3 veces con 100 µl de tampón de urea e, a continuación, centrifugue.A mesma operación realizouse 3 veces usando 100 μl de bicarbonato de amonio 100 mM.Antes da tripsinización, substituír o tubo de recollida por un novo.Engadir tampón de dixestión que contén 50 mM de bicarbonato de amonio e 1 µl de tripsina diluída en tampón de tripsina (Promega).A proporción de tripsina a proteína mantívose en aproximadamente 1:33, e as reaccións de dixestión incubáronse durante a noite a 37 °C nunha cámara húmida.O péptido reticulado eluíuse do filtro por centrifugación durante 25 minutos.A recuperación do péptido mellorouse engadindo 50 μl de NaCl 0,5 M ao filtro, seguido de centrifugación durante 25 minutos.
Utilizáronse columnas C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) para desalar péptidos trípticos entrecruzados seguindo o protocolo descrito por Bouchal et al.70 con pequenas modificacións.Brevemente, as columnas de spin C18 activáronse con tres lavados de ácido fórmico (FA) ao 0,1% en acetonitrilo (AcN) (Merck) e dous lavados de ácido fórmico (FA) ao 0,1%.A columna foi hidratada con 0,1% FA durante 15 minutos.Cargue as mostras en columnas de centrifugado e lave 3 veces con 0,1% de FA.Os péptidos desalados eluíronse secuencialmente cun gradiente por pasos usando AcN ao 50%, 80% e 100% en FA ao 0,1%.As mostras secáronse nun concentrador SpeedVac Plus (Eppendorf) ata que o líquido residual desapareceu por completo.Os péptidos eluídos disolvéronse en 100 μl de ácido trifluoroacético ao 0,08% en AcN ao 2,5% e as concentracións midéronse nun NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Aproximadamente 1 μg de péptido reticulado por mostra foi inxectado no sistema LC-MS/MS.
Os péptidos entrecruzados separáronse nun sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) conectado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Os péptidos entrecruzados foron recollidos nunha columna de captura C18 µ-pre-columna de 300 µm de ID e 5 mm de lonxitude empaquetada con sorbente C18 PepMap100 e sorbente PepMap de 5 µm (Thermo Scientific).Cargue o caudal da bomba fixado a 5 µl/min de ácido trifluoroacético ao 0,08% disolto en AcN ao 2,5%.Os péptidos entrecruzados separáronse nunha columna de sílice fundida analítica cun diámetro interior de 75 μm e unha lonxitude de 150 mm, rechea cun adsorbente PepMap de 2 μm (Thermo Scientific).As fases móbiles A e B estaban formadas por 0,1% FA en auga e 0,1% FA en acetonitrilo, respectivamente.O gradiente comeza no 2,5 % de B e aumenta linealmente ata o 40 % de B durante 90 minutos, despois ata o 90 % de B durante os seguintes 2 minutos.A composición da fase móbil mantívose ao 90% de B durante 10 minutos e despois diminuíu linealmente ata o 2,5% de B durante 2 minutos.A columna equilibrouse ao 2,5% de B durante 8 minutos antes do seguinte ciclo.Os péptidos entrecruzados eluídos da columna analítica ionizáronse nunha fonte de ionización por nanoelectrospray (NSI) e inxectáronse nun espectrómetro de masas Exploris 480 (Thermo Scientific).
O espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 funcionou no modo de correlación de datos positiva.Realizouse unha exploración completa en modo de sección cunha resolución de 120.000 con axustes de rango de m/z 350 Th a m/z 2000 Th.O obxectivo de AGC normalizado estableceuse nun 300 % cun tempo de entrada máximo de 50 ms.Estableceuse a detección de picos monoisotópicos para os péptidos.O parámetro de relaxación da restrición establécese como verdadeiro se se atopan moi poucos precursores.A forza iónica mínima do precursor estableceuse en 5,0e3 e os estados de carga do precursor ata +8 foron incluídos nos experimentos.
O tempo de ciclo entre as exploracións principais no modo de correlación de datos estableceuse en 2,5 segundos.A exclusión de masa dinámica estableceuse en 20 s despois da primeira fragmentación do ión precursor.A xanela de illamento do precursor estableceuse en 2 Th.Escolleuse o tipo de enerxía de colisión normalizada cun modo de enerxía de colisión fixo nunha exploración MS/MS dependente dos datos.Enerxía de colisión establecida no 30 %.A resolución Orbitrap estableceuse en 15.000 e o obxectivo AGC no 100%.O tempo de inxección máximo personalizado está establecido en 60 milisegundos.
Antes de rastrexar a rede proteína-proteína en mostras entrecruzadas, procesamos os ficheiros en bruto usando o paquete MaxQuant (versión 1.6.12.0)26,27 para identificar péptidos/proteínas rastreables nas mostras.Ademais, realizáronse análises proteómicas similares en mostras de Flo-1 non reticuladas tratadas e non tratadas con IFNα.Os datos de MS/MS foron buscados na base de datos humana UniProt (www.uniprot.org) (cargada o 12 de agosto de 2020, contén 75.093 entradas) mediante o buscador integrado Andromeda27.A busca realizouse sen indicar a especificidade do encima e diversas modificacións de desamidación (N, Q) e oxidación (M).As tolerancias de masa do precursor fixéronse en 20 ppm e os ións do produto en 0,02 Da.A desviación de masa inicial e máxima estableceuse en 10 ppm.A masa máxima do péptido estableceuse en 4600 Da e a semellanza de secuencias estableceuse entre 7 e 25 aminoácidos (aa).Realizouse unha análise estatística adicional mediante o programa Perseus (versión 1.6.10.45).O contido de proteína calculouse normalizando a intensidade espectral da proteína (intensidade LFQ; cuantificación sen etiqueta)27 e os valores de intensidade convertéronse a Log2.Creouse un agrupamento xerárquico de proteínas identificadas pola súa intensidade peptídica utilizando o paquete pheatmap (v1.0.12) en R (v 4.1.2).A análise de enriquecemento da vía realizouse mediante a base de datos de vías Reactome para proteínas tratadas con IFNα que se activaron máis de catro veces en comparación coas mostras non tratadas.
A identificación de enlaces cruzados químicos específicos de lisina (K) ou serina (S) de complexos proteicos monitorizados por LC-MS/MS realizouse mediante unha máquina de identificación espectroscópica (SIM-XL) para péptidos entrecruzados (SIM-XL)29.En primeiro lugar, investigáronse as posibles interaccións entre os xenes de sinatura de resistencia ao dano do ADN (IRDS) asociados ao interferón (IFN) utilizando o conxunto de datos de proteínas IRDS descrito en Padariya et al.28.A selección de todas as condicións e repeticións de todo o UniProt humano é computacionalmente intensivo, polo que toda a base de datos de UniProt humana (www.uniprot.org) (descargada o 12 de agosto de 2020, contén 75.093 entradas) contra repeticións tratadas con IFNα.Un dos filtros para interaccións de alta confianza.Estas interaccións de alta significación obtidas foron ampliadas e probadas en todas as repeticións e condicións.
En SIM-XL, DSS utilizouse para o reticulante (XL) e o cambio de peso XL e o cambio de peso de modificación fixéronse en 138,06 e 156,07, respectivamente.Considéranse os seguintes sitios de reacción de reticulación: KK, KS e KN-TERM, sen ións indicadores.Tanto o precursor como o fragmento ppm establecéronse en 20 e o limiar Xrea en 0,15.Considerouse que a tripsina era completamente específica e implementouse un método de fragmentación de trampa C de alta enerxía (HCD).O limiar de redución de DB dinámica XCorr e o número mínimo de péptidos para a redución de DB dinámica establecéronse en 2,5 e 2, respectivamente.Outros parámetros son: probabilidade de monoisótopos e corte de coincidencia de pico, mínimo 4 residuos de AA por febra e carga máxima da febra e 3 máximos de divisións perdidas.Os mapas 2D cosidos resultantes foron analizados en (SIM-XL) e utilizouse a representación gráfica de xQuest28 para construír os mapas 2D.Os enlaces cruzados de proteínas nas estruturas de proteínas son proporcionados en PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versión 2.0 Schrödinger, LLC).
Creáronse estruturas de modelos de proteínas utilizando o servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 utilizando os principios de modelado de homoloxía e implementación do “Método de Markov Oculto”.Phyre2 xera estruturas modelo baseadas no aliñamento de secuencias con estruturas de proteínas coñecidas.Para as proteínas H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 e MDN1, utilizáronse as estruturas modelo 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 e 6i2665.Ademais, tamén se considerou a estrutura de AlphaFold71 MX1, UBP18 e ROBO1.A estrutura da proteína visualizouse mediante o paquete BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, EUA) e o paquete Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).