Tubo enrolado de aceiro inoxidable 347 12,7*1,24 mm, mecanismo molecular de condensación electrostática síncrona e coagregación de α-sinucleína e tau

Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Control deslizante que mostra tres artigos por diapositiva.Usa os botóns atrás e seguinte para moverte polas diapositivas ou os botóns do controlador de diapositivas ao final para moverte por cada diapositiva.

Especificación de tubos de aceiro inoxidable 347

347 12,7*1,24 mm Tubo enrolado de aceiro inoxidable

Diámetro exterior: 6,00 mm OD ata 914,4 mm OD, tamaños ata 24” NB dispoñible en stock, tamaño OD Tubos de aceiro dispoñibles en stock

SS 347 Rango de espesor de tubo: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
PESO: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Ou tamaño non normal para adaptalo segundo sexa necesario

Tipo: Tubos sen costura SS 347 |Tubos SS 347 ERW |SS 347 Tubos soldados |SS 347 Tubos fabricados |Tubos SS 347 CDW, tubos LSAW / Soldados con costura / Redibujado

Forma: tubos/tubos redondos SS 347, tubos/tubos cadrados SS 347, tubos/tubos rectangulares SS 347, tubos en espiral SS 347, forma en “U” SS 347, bobinas para torta SS 347, tubos hidráulicos SS 347

Lonxitude: aleatoria simple, aleatoria dobre e lonxitude requirida Extremo: extremo liso, extremo biselado, pisado

Protección final: Tapas de plástico |Acabado exterior: 2B, No.4, No.1, No.8 Acabado espello para tubos de aceiro inoxidable, acabado segundo os requisitos do cliente

Condición de entrega: recocido e decapado, pulido, recocido brillante, estirado en frío

Inspección, informes de probas: certificados de proba de molino, EN 10204 3.1, informes químicos, informes mecánicos, informes de probas PMI, informes de inspección visual, informes de inspección de terceiros, informes de laboratorio aprobados por NABL, informes de probas destrutivas, informes de probas non destrutivas

Embalaxe: embalado en caixas de madeira, bolsas de plástico, tiras de aceiro empaquetadas ou segundo as solicitudes dos clientes

Especiais: Pódense fabricar tamaños e especificacións distintas das anteriores baixo petición

SS 347 Rango de tamaño de tubo: 1/2 polgada NB, OD a 24 polgadas

ASTM A312 347: Tubo austenítico soldado sen costura e de costura recta destinado a alta temperatura e servizo corrosivo xeral.Non se permite metal de recheo durante a soldadura.

ASTM A358 347: Tubo austenítico soldado por fusión eléctrica para servicio corrosivo y/ou a alta temperatura.Normalmente só se producen tubos de ata 8 polgadas con esta especificación.Permítese a adición de metal de recheo durante a soldadura.

ASTM A790 347: Tubo ferrítico/austenítico (dúplex) soldado sen costura e de costura recta destinado ao servizo corrosivo xeral, con especial énfase na resistencia á fisuración por corrosión por tensión.

ASTM A409 347: Tubo de pared ligera austenítica de gran diámetro soldado por fusión eléctrica de costura recta o en espiral en tamaños de 14" a 30" con paredes Sch5S y Sch 10S para corrosivos y/ou altos

ASTM A376 347: Tubo austenítico sen costura para aplicacións a alta temperatura.

ASTM A813 347: Tubo austenítico de costura única, simple ou dobre soldado para alta temperatura e aplicacións corrosivas xerais.

ASTM A814 347: Tubo austenítico soldado en frío para alta temperatura e servizo corrosivo xeral.

Composición química de tubos de aceiro inoxidable 347H

Propiedades mecánicas do tubo de aceiro inoxidable 347H

Propiedades físicas dos tubos de aceiro inoxidable 347H

Graos equivalentes para tubos de aceiro inoxidable 347H

A agregación de amiloide alfa-sinucleína (αS) é un selo distintivo da enfermidade de Parkinson e outras sinucleinopatías.Recentemente, a proteína tau asociada habitualmente á enfermidade de Alzheimer asociouse coa patoloxía αS ​​e descubriuse que se co-localiza en inclusións ricas en αS, aínda que o mecanismo molecular de coagregación das dúas proteínas segue sen estar claro.Informamos aquí de que a fase αS sepárase en condensados ​​líquidos mediante condensación de complexos electrostáticos con polipéptidos cargados positivamente como tau.Dependendo da afinidade de αS polos policationes e da taxa de esgotamento da valencia da rede de coagulación, os coágulos sofren unha rápida xelación ou coalescencia seguida dunha lenta agregación de amiloide.Ao combinar un conxunto de técnicas biofísicas avanzadas, puidemos caracterizar a separación de fases αS/Tau líquido-líquido e identificar os factores clave que conducen á formación de agregados heteroxéneos que conteñen ambas proteínas nun condensado de proteína líquida.
Ademais dos compartimentos de membrana, a separación espacial nas células tamén se pode conseguir mediante a formación de corpos densos líquidos e ricos en proteínas chamados condensados ​​biomoleculares ou gotículas, mediante un proceso coñecido como separación de fase líquido-líquido (LLPS).Estas gotículas están formadas por interaccións temporais multivalentes, xeralmente entre proteínas ou proteínas e ARN, e cumpren unha variedade de funcións en case todos os sistemas vivos.Un gran número de proteínas capaces de LLP presentan secuencias de baixa complexidade que están moi desordenadas na natureza e na formación de condensados ​​biomoleculares3,4,5.Numerosos estudos experimentais revelaron a natureza flexible, moitas veces desordenada e multivalente das proteínas que forman estes condensados ​​de tipo líquido, aínda que pouco se sabe sobre os determinantes moleculares específicos que controlan o crecemento e a maduración destes condensados ​​a unha forma máis sólida. estado..
Os novos datos apoian a hipótese de que o LLPS aberrante impulsado por proteínas e a transformación de gotículas en estruturas sólidas poden ser vías celulares relevantes que conducen á formación de agregados tóxicos insolubles que adoitan ser selos distintivos de enfermidades dexenerativas.Moitas proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) asociadas a LLPS, moitas veces altamente cargadas e flexibles, estiveron asociadas dende hai tempo coa neurodexeneración a través do proceso de agregación de amiloide.En particular, os condensados ​​de IDP biomoleculares como FUS7 ou TDP-438 ou proteínas con grandes dominios de baixa complexidade como hnRNPA19 envellecen en formas similares a xel ou incluso sólidas mediante un proceso chamado fluidización.composto.á transición en fase sólida (LSPT) en función do tempo ou en resposta a determinadas modificacións postraducionais ou mutacións patoloxicamente significativas1,7.
Outro IDP asociado con LLPS in vivo é a Tau, unha proteína desordenada asociada a microtúbulos cuxa agregación amiloide estivo implicada na enfermidade de Alzheimer10 pero que tamén estivo implicada recentemente na enfermidade de Parkinson (EP) e outras proteinopatías nucleares sinápticas 11, 12, 13 están relacionadas.Demostrouse que o tau se disocia espontáneamente da solución/citoplasma debido a interaccións electrostáticas favorables14, o que orixina a formación de gotas enriquecidas en tau coñecidas como coacervados electrostáticos.Tamén se observou que este tipo de interacción inespecífica é o motor de moitos condensados ​​biomoleculares na natureza15.No caso dunha proteína tau, a agregación electrostática pode formarse por agregación simple, na que rexións da proteína con carga oposta desencadean o proceso de escisión, ou por agregación complexa mediante a interacción con polímeros cargados negativamente como o ARN.
Recentemente, a α-sinucleína (αS), un IDP amiloide implicado na PD e outras enfermidades neurodexenerativas coñecidas colectivamente como sinucleinopatía17,18, demostrouse en modelos celulares e animais19,20 concentrado en condensados ​​de proteínas con comportamento similar ao fluído.Estudos in vitro demostraron que αS sofre LLPS por simple agregación mediante interaccións predominantemente hidrófobas, aínda que este proceso require concentracións de proteínas excepcionalmente altas e tempos de incubación atípicamente longos19,21.Se os condensados ​​que conteñen αS observados in vivo están formados por este ou outros procesos LLPS segue sendo un problema clave sen resolver.Do mesmo xeito, aínda que se observou a agregación de amiloide αS en neuronas en PD e outras sinucleinopatías, o mecanismo exacto polo que αS sofre agregación amiloide intracelular segue sen estar claro, xa que a sobreexpresión desta proteína non parece desencadear este proceso por si só.Moitas veces é necesario un dano celular adicional, o que suxire que se requiren certas localizacións celulares ou microambientes para a renucleación de conxuntos amiloides αS intracelulares.Un ambiente celular que é particularmente propenso á agregación pode ser o interior dos condensados ​​de proteínas 23 .
Curiosamente, descubriuse que αS e tau se co-localizan en inclusións de enfermidades características en humanos con enfermidade de Parkinson e outras sinucleinopatías 24,25 e os experimentos informaron dunha relación patolóxica sinérxica entre as dúas proteínas 26,27 o que suxire unha relación potencial entre a agregación αS e a tau. tau en enfermidades neurodexenerativas.enfermidade.Atopouse que αS e tau interactúan e promoven a agregación mutua in vitro e in vivo 28,29 e observáronse agregados heteroxéneos compostos por estas dúas proteínas no cerebro de pacientes con sinucleinopatías 30 .Porén, sábese pouco sobre a base molecular da interacción entre αS e tau e o mecanismo da súa co-agregación.Informese que αS interactúa coa tau mediante unha atracción electrostática entre a rexión C-terminal altamente cargada negativamente de αS e a rexión central rica en prolina de tau, que tamén está enriquecida en residuos cargados positivamente.
Neste estudo, mostramos que αS pode disociarse en gotículas mediante a condensación do complexo electrostático en presenza de proteína tau, en contraste coa súa interacción con outros polipéptidos cargados positivamente como a poli-L-lisina (pLK) e neste proceso.αS actúa como unha molécula de armazón para a rede de gotas.Identificamos diferenzas notables no proceso de maduración dos coacervados αS electrostáticos, que están asociadas a diferenzas na valencia e na forza da interacción das proteínas implicadas na rede de coacervados.Curiosamente, observamos a co-agregación de proteínas amiloides αS e tau en coacervados líquidos de longa duración e identificamos algúns factores clave que conducen á co-agregación destas dúas proteínas en tales coacervados.Aquí describimos en detalle este proceso, que é un posible mecanismo molecular subxacente á colocalización de dúas proteínas en inclusións específicas da enfermidade.
αS ten unha cola C-terminal altamente aniónica a pH neutro (Fig. 1a), e plantexamos a hipótese de que podería sufrir LLPS mediante a condensación de complexos electrostáticos con moléculas polipeptídicas policatiónicas desordenadas.Usamos unha poli-L-lisina (pLK) de 100 residuos como molécula modelo de partida debido á súa natureza polimérica cargada positivamente e desordenada a pH neutro 32. En primeiro lugar, confirmamos que pLK interactúa co dominio Ct de αS mediante espectroscopia de RMN en solución. (Figura 1b) usando αS marcado con 13C/15N en presenza de relacións molares crecentes αS:pLK.A interacción de pLK co dominio Ct de αS maniféstase en perturbacións do desprazamento químico e unha diminución da intensidade máxima nesta rexión da proteína.Curiosamente, cando mesturamos αS con pLK a unha concentración de αS de aprox.5-25 µM en presenza de polietilenglicol (5-15% PEG-8) (tampón LLPS típico: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) inmediatamente atravesamos un amplo campo de formación de proteínas. .As pingas foron observadas mediante microscopía de fluorescencia (WF) e de campo brillante (BF) (Fig. 1c).Gotas de 1-5 µm que conteñen αS concentrado (agregado 1 µM de αS marcado con AlexaFluor488, AF488-αS), as súas propiedades electrostáticas pódense derivar da súa resistencia ao 1,6-hexanodiol (1,6-HD) e da súa sensibilidade a un aumento da concentración de NaCl (Fig. 1c).A natureza fluída dos coacervados do complexo electrostático αS/pLK demóstrase pola súa capacidade de fusionarse en milisegundos (Fig. 1d).Usando turbidimetría, cuantificamos a formación de gotas nestas condicións, confirmamos a natureza electrostática da principal interacción asociada á súa estabilidade (Fig. 1e) e avaliamos o efecto de varias proporcións de polímeros no proceso LLPS (Fig. 1f).Aínda que se observa a formación de gotas nunha ampla gama de relacións de polímeros, o proceso é moi favorable cando o pLK supera o αS.Tamén se observaron LLPs usando o axente desprazador quimicamente diferente dextrano-70 (70 kDa) ou utilizando unha variedade de formatos de mostra, incluíndo gotas de portaobjetos de vidro, pozos de microplacas de diversos materiais, capilares de Eppendorf ou de cuarzo.
a Representación esquemática de diferentes rexións proteicas nas variantes WT-αS e ΔCt-αS utilizadas neste estudo.O dominio N-terminal anfipático, a rexión hidrofóbica de formación de amiloide (NAC) e o dominio C-terminal cargado negativamente móstranse en azul, laranxa e vermello, respectivamente.Móstrase o mapa Net Charge Per Residual (NCPR) de WT-αS.b Análise de RMN da interacción αS/pLK en ausencia de cúmulos macromoleculares.A medida que aumenta a concentración de pLK (as proporcións molares de αS:pLK de 1:0,5, 1:1,5 e 1:10 móstranse en verde claro, verde e verde escuro, respectivamente).c Coacerva αS/pLK (relación molar 1:10) a 25 µM (1 µM pLK marcado con AF488 ou Atto647N para imaxes WF) en tampón LLPS (arriba) ou complementado con NaCl 500 mM (abajo esquerdo) ou despois de 110 % 1,6-hexanodiol (1,6-HD; inferior dereita).Barra de escala = 20 µm.d Imaxes microscópicas representativas da fusión de gotas BF de αS/pLK (relación molar 1:10) a unha concentración de 25 μM;as frechas indican a fusión de pingas individuais (frechas vermellas e amarelas) nunha nova pinga (frecha laranxa) nun prazo de 200 ms).Barra de escala = 20 µm.e Dispersión da luz (a 350 nm) Agregación αS/pLK en tampón LLPS antes e despois da adición de NaCl 500 mM ou 1,6-HD 10% a αS 25 µM (N = 3 réplicas de mostra, tamén se indica a media e a desviación estándar).f Imaxe BF (arriba) e análise de dispersión da luz (a 350 nm, inferior) da agregación αS/pLK a 25 μM αS cun aumento da relación molar αS:pLK (N = 3 réplicas de mostra, tamén se indica a media e a desviación estándar).Barra de escala = 10 µm.A barra de escala nunha imaxe indica a escala de todas as imaxes nun panel.Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
Baseándonos nas nosas observacións de condensación do complexo electrostático αS/pLK e observacións previas de αS como molécula cliente do condensado de tau/ARN mediante a interacción directa con tau31, plantexamos a hipótese de que αS e tau poderían co-segregarse co disolvente en ausencia de ARN. condensación.a través de complexos electrostáticos, e αS é a proteína de armazón nos coacervados αS/Tau (ver distribución de carga tau na Figura 2e).Observamos que cando se mesturaron 10 μM αS e 10 μM Tau441 (que conteñen 1 μM AF488-αS e 1 μM Atto647N-Tau, respectivamente) no tampón LLPS, formaron facilmente agregados de proteínas que conteñen ambas proteínas, como se observa pola microscopía WF.(Fig. 2a).A colocalización das dúas proteínas nas gotículas confirmouse mediante microscopía confocal (CF) (figura complementaria 1a).Observouse un comportamento semellante cando se utilizou o dextrano-70 como axente de agregación (figura complementaria 1c).Usando PEG ou dextrano marcado con FITC, descubrimos que ambos os axentes de aglomeración estaban distribuídos uniformemente entre as mostras, sen mostrar segregación nin asociación (figura complementaria 1d).Pola contra, suxire que neste sistema promoven a separación de fases mediante efectos de aglomeración macromolecular, xa que o PEG é un axente de aglomeración preferentemente estable, como se observa noutros sistemas LLP33,34.Estas gotas ricas en proteínas eran sensibles ao NaCl (1 M) pero non ao 1,6-HD (10% v/v), confirmando as súas propiedades electrostáticas (Figura 2a, b complementaria).O seu comportamento fluído foi confirmado mediante a observación de eventos de gotas de fusión de milisegundos mediante microscopía BF (Fig. 2b).
a Imaxes de microscopía confocal (CF) de αS/Tau441 coacerva no tampón LLPS (10 μM de cada proteína, 0,5 μM de αS marcado con AF488 e Tau441 marcado con Atto647N).b Imaxes representativas de contraste de interferencia diferencial (DIC) dos eventos de fusión de gotas αS/Tau441 (10 μM por cada proteína).c Diagrama de fase baseado na dispersión da luz (a 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) en ausencia (esquerda) ou presenza (dereita) de 50 µM αS.As cores máis cálidas indican máis dispersión.d Dispersión da luz de mostras de αS/Tau441 LLPS cunha concentración crecente de αS (Tau441 a 5 µM, N = 2-3 repeticións de mostras como se indica).e Representación esquemática dalgunhas variantes da proteína tau e diferentes rexións da proteína utilizada neste estudo: dominio N-terminal cargado negativamente (vermello), rexión rica en prolina (azul), dominio de unión a microtúbulos (MTBD, resaltado en laranxa) e espiral de par formador de amiloide.rexións de filamentos (PHF) situadas dentro do MTBD (gris).Móstrase o mapa Net Charge Per Residue (NCPR) de Tau441.f Usando αS marcado con AF488 1 µM e ΔNt- marcado con Atto647N, utilizando αS ou ΔCt-αS marcados con AF488 1 µM en presenza de ΔNt-Tau (arriba, 10 µM por proteína) ou K18 (inferior, 10 µM por proteína). ) ) ) micrografías de WF condensadas en LLPS ou tampón K18.As barras de escala nunha imaxe representan a escala de todas as imaxes nun panel (20 µm para os paneis a, b e f).Os datos en bruto dos paneis c e d ofrécense como ficheiros de datos en bruto.
Para probar o papel de αS neste proceso LLPS, primeiro investigamos o efecto da αS sobre a estabilidade das pingas mediante nefelometría utilizando concentracións crecentes de NaCl (Fig. 2c).Canto maior sexa a concentración de sal nas mostras que conteñen αS, máis altos serán os valores de dispersión da luz (a 350 nm), o que indica o papel estabilizador do αS neste sistema LLPS.Pódese observar un efecto similar aumentando a concentración de αS (e, polo tanto, a relación αS:Tau441) a aprox.Aumento de 10 veces en relación á concentración de tau (5 µM) (Fig. 2d).Para demostrar que αS é unha proteína de armazón nos coacervados, decidimos investigar o comportamento do mutante Tau alterado por LLPS, que carece dunha rexión N-terminal cargada negativamente (residuos 1-150, ver figura 2e) chamada ΔNt-Tau.A microscopía WF e a nefelometría confirmaron que o propio ΔNt-Tau non sufriu LLPS (Fig. 2f e Fig. 2d complementaria), como se informou anteriormente 14. Non obstante, cando se engadiu αS ás solucións de dispersión desta variante de Tau truncada, o proceso LLPS foi completamente. restaurado cunha densidade de gotas próxima á densidade de gotas das solucións de tamaño real de Tau e αS en condicións e concentracións de proteínas similares.Este proceso tamén se pode observar en condicións de baixo aglomeración macromolecular (figura complementaria 2c).O papel da rexión αS C-terminal, pero non toda a súa lonxitude, no proceso LLPS demostrouse mediante a inhibición da formación de gotas mediante unha variante αS truncada C-terminal que carece de residuos 104-140 (Fig. 1a) do (ΔCt-). proteína αS) (figura 2f e figura complementaria 2d).A colocalización de αS e ΔNt-Tau confirmouse mediante microscopía de fluorescencia confocal (figura complementaria 1b).
Para probar aínda máis o mecanismo LLPS entre Tau441 e αS, utilizouse unha variante adicional de Tau, a saber, o fragmento de núcleo de filamento helicoidal emparellado (PHF) no dominio de unión a microtúbulos (MTBD), que se contén catro dominios de repetición característicos, comunmente tamén coñecidos. como o fragmento K18 (ver Fig. 2e).Recentemente informouse de que αS únese preferentemente a unha proteína tau situada nun dominio rico en prolina nunha secuencia que precede ao dominio de unión aos microtúbulos.Non obstante, a rexión PHF tamén é rica en residuos cargados positivamente (ver Figura 2e), especialmente lisina (15% de residuos), o que nos levou a comprobar se esta rexión tamén contribúe á condensación do complexo αS/Tau.Observamos que K18 só non podía desencadear LLPS en concentracións de ata 100 μM nas condicións probadas (tampón LLPS cun 15% de PEG ou 20% de dextrano) (Figura 2f).Non obstante, cando engadimos 50 µM αS a 50 µM K18, observouse a formación rápida de gotas de proteína que conteñen K18 e αS mediante nefelometría (figura complementaria 2d) e microscopía WF (figura 2f).Como era de esperar, ΔCt-αS non puido restaurar o comportamento LLPS de K18 (Fig. 2f).Observamos que a agregación de αS/K18 require concentracións de proteínas lixeiramente máis altas para inducir LLPS en comparación con αS/ΔNt-Tau ou αS/Tau441, sendo outras cousas iguais.Isto é consistente cunha interacción máis forte da rexión C-terminal αS co dominio Tau rico en prolina en comparación co dominio de unión aos microtúbulos, como se describiu anteriormente 31 .
Dado que ΔNt-Tau non pode realizar LLPS en ausencia de αS, escollemos esta variante Tau como modelo para caracterizar αS/Tau LLPS dada a súa sinxeleza en sistemas LLPS con Tau de lonxitude total (isotipo, Tau441/Tau441).con procesos de agregación complexos (heterotípicos, αS/Tau441).Comparamos o grao de agregación αS (como parte da proteína de fase condensada, fαS,c) nos sistemas αS/Tau e αS/ΔNt-Tau mediante centrifugación e análise SDS-PAGE en fase dispersa (ver 2e), atopamos valores moi similares. para todas as proteínas á mesma concentración.En particular, obtivemos fαS,c 84 ± 2% e 79 ± 7% para αS/Tau e αS/ΔNt-Tau, respectivamente, o que suxire que a interacción heterotípica entre αS e tau é superior á interacción entre as moléculas de tau.entre.
A interacción con varios policationes e o efecto do proceso de condensación na cinética αS foron estudados por primeira vez mediante o método de recuperación de fluorescencia despois de fotoblanqueamento (FRAP).Probamos os coacervados αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK (100 μM αS complementado con 2 μM αS AF488-αS e 100 μM Tau441 ou ΔNt-Tau ou 1 mM pLK).Os datos obtivéronse nos primeiros 30 minutos despois da mestura dos compoñentes da mostra.A partir de imaxes FRAP representativas (Fig. 3a, condensación αS/Tau441) e as súas correspondentes curvas de curso temporal (Fig. 3b, Fig. 3 complementaria), pódese ver que a cinética αS é moi semellante á dos coacervados de Tau441.e ΔNt-Tau, que é moito máis rápido con pLK.Os coeficientes de difusión calculados para αS dentro do coacervado segundo FRAP (como descrito por Kang et al. 35) son D = 0,013 ± 0,009 µm2/s e D = 0,026 ± 0,008 µm2/s para αS/Tau441 e αNt-S para/Δ o sistema αS/.pLK, Tau e D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectivamente (Fig. 3c).Non obstante, o coeficiente de difusión αS na fase dispersa é varias ordes de magnitude maior que todas as fases condensadas, segundo o determinado pola espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS, ver a figura complementaria 3) nas mesmas condicións (tampón LLPS) pero en ausencia de policationos. (D = 8 ± 4 µm2/s).Polo tanto, a cinética da tradución de αS redúcese significativamente nos coacervados en comparación coas proteínas na fase dispersa debido aos pronunciados efectos de apiñamento molecular, aínda que todos os coacervados conservan propiedades líquidas durante a primeira media hora despois da súa formación, en contraste coa fase tau.cinética máis rápida no condensado pLK.
a–c Análise FRAP da dinámica de αS (αS marcado con AF488 ao 2%) en coacervados electrostáticos.As imaxes representativas dos ensaios FRAP αS/Tau441 por triplicado móstranse en (a), onde os círculos vermellos indican áreas decoloradas.A barra de escala é de 5 µm.b Curvas medias de FRAP e (c) coeficientes de difusión calculados (D) para 5–6 (N) gotas diferentes de tres experimentos utilizando 100 µM de αS e concentracións equimolares de Tau441 (vermello) ou ΔNt-Tau (azul) ou pLK (verde) a dez veces a concentración de LLPS.A desviación estándar da curva FRAP móstrase en cor sombreada.Para comparación, o coeficiente de difusión αS na fase dispersa determinouse por triplicado mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) (consulte a Figura 3 complementaria e os métodos para obter máis información).d Espectros continuos de EPR en banda X de 100 μM TEMPOL-122-αS en tampón LLPS sen policación (negro) ou en presenza de 100 μM Tau441 (vermello) ou ΔNt-Tau (azul) ou 1 mM pLK (verde).O recuadro mostra unha vista ampliada das fortes liñas de campo onde se producen os cambios máis dramáticos.e Curvas de unión de 50 μM TEMPOL-122-αS con varios policationos en ausencia de LLPS (sen PEG).A amplitude reducida da banda III en comparación coa banda II (IIII/III) do espectro EPR normalizado aumenta as relacións molares de Tau441 (vermello), ΔNt-Tau (azul) e pLK (verde).As liñas de cores mostran o axuste aos datos mediante un modelo de unión aproximado con n sitios de unión idénticos e independentes en cada curva.Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
Como complemento, investigamos a dinámica de αS en varios coacervados mediante o etiquetado de espín dirixido (SDSL) e a resonancia paramagnética electrónica continua (CW-EPR).Este método demostrou ser moi útil para informar da flexibilidade e dinámica do IDP cunha resolución residual realista36,37,38.Para iso, construímos residuos de cisteína en mutantes de Cys únicos e utilizamos a sonda de spin 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxilo (TEMPOL).Os derivados da maleimida os etiquetan.Máis concretamente, inserimos sondas TEMPOL na posición 122 ou 24 αS (TEMPOL-122-αS e TEMPOL-24-αS).No primeiro caso, dirixímonos á rexión C-terminal da proteína, que está implicada na interacción cos policationos.Pola contra, a posición 24 pode darnos información sobre a dinámica global das proteínas do condensado.En ambos os casos, os sinais EPR obtidos para as proteínas da fase dispersa corresponderon a radicais de nitróxido en estado de movemento rápido.Despois da separación de fase en presenza de tau ou pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ou ΔNt-Tau nunha proporción de 1:1 ou pLK nunha proporción de 1:10), observouse un aumento da intensidade do pico relativo en o espectro EPR de αS.A liña de perda ampliouse, o que indica unha cinética de reorientación αS reducida en gotículas en comparación coa proteína en fase diluída (figura 3d, figura complementaria 4a).Estes cambios son máis pronunciados na posición 122. Mentres que na posición 24 a presenza de pLK non afectou á cinética da sonda, na posición 122 a forma da liña espectral cambiou significativamente (figura complementaria 4a).Cando tentamos modelar os espectros na posición 122 de dous sistemas αS/polication usando o modelo isótropo (Figura complementaria 5a) que se usa habitualmente para describir a dinámica do IDP38,39 marcado con spin, non puidemos reconstruír os espectros experimentais..Simulación espectral da posición dos contrastes de 24 spins (figura complementaria 5a).Isto suxire que hai posicións preferentes no espazo das configuracións de espín da rexión C-terminal de αS en presenza de policationes.Ao considerar a fracción de αS na fase condensada en condicións experimentais de EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% e 47 ± 4% para αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK, respectivamente, consulte o suplemento). Figura 2e da ​​análise de datos c), pódese ver que o ensanchamento detectado polo método EPR reflicte principalmente a interacción da rexión C-terminal de αS con varios policationes na fase condensada (o principal cambio cando se usa TEMPOL-122-). αS), e non condensación de proteínas.Obsérvase un aumento da microviscosidade na sonda.Como era de esperar, o espectro EPR da proteína en condicións distintas do LLPS restableceuse por completo cando se engadiu 1 M NaCl á mestura (figura complementaria 4b).En xeral, os nosos datos suxiren que os cambios detectados por CW-EPR reflicten principalmente a interacción da rexión C-terminal de αS con varios policationes na fase condensada, e esta interacción parece ser máis forte con pLK que con Tau.
Para obter máis información estrutural sobre as proteínas do coacervado, decidimos estudar o sistema LLPS mediante RMN en solución.Non obstante, só puidemos detectar a fracción αS que queda na fase dispersa, o que pode deberse á redución da dinámica das proteínas no interior do coacervado e a unha fase densa no fondo da solución na análise de RMN.Cando analizamos a estrutura e a dinámica da proteína que queda na fase dispersa da mostra de LLPS mediante RMN (Figura complementaria 5c, d), observamos que a proteína se comportaba de forma case idéntica en presenza de pLK e ΔNt-Tau, ambos os dous. que estaban na estrutura e dinámica secundarias da columna vertebral das proteínas, reveladas por experimentos sobre desprazamento químico secundario e relaxación de R1ρ.Os datos de RMN mostran que o extremo C-terminal de αS sofre unha perda significativa de flexibilidade conformacional mentres conserva a súa natureza desordenada, como o resto da secuencia proteica, debido ás súas interaccións cos policationes.
Dado que o ensanchamento do sinal CW-EPR observado na fase condensada TEMPOL-122-αS reflicte a interacción da proteína cos policationos, realizamos unha titulación EPR para avaliar a afinidade de unión de αS a varios policationes en ausencia de LLPS (sen acumulación de Buffer LLPS), o que suxire que as interaccións son as mesmas nas fases diluída e concentrada (o que está confirmado polos nosos datos, figura complementaria 4a e figura complementaria 6).O obxectivo era ver se todos os coacervados, a pesar das súas propiedades comúns de fluído, presentan algún comportamento diferencial subxacente a nivel molecular.Como era de esperar, o espectro EPR ampliouse co aumento da concentración de polication, o que reflicte unha diminución da flexibilidade molecular debido ás interaccións moleculares de todos os socios de interacción case ata a saturación (figura 3e, figura complementaria 6).pLK conseguiu esta saturación nunha proporción molar inferior (polication:αS) en comparación con ΔNt-Tau e Tau441.De feito, a comparación dos datos cun modelo de unión aproximado asumindo n sitios de unión idénticos e independentes mostrou que a constante de disociación aparente de pLK (~5 μM) é unha orde de magnitude inferior á de Tau441 ou ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Aínda que esta é unha estimación aproximada, isto suxire que αS ten unha maior afinidade por policationes máis simples con rexións de carga positiva continua.Dada esta diferenza de afinidade entre αS e varios policationes, plantexamos a hipótese de que as súas propiedades líquidas poden cambiar de forma diferente ao longo do tempo e, polo tanto, sufrir diferentes procesos LSPT.
Dado o ambiente moi ateigado dentro do coacervado de proteínas e a natureza amiloide da proteína, observamos o comportamento do coacervado ao longo do tempo para detectar posibles procesos LSPT.Usando microscopía BF e CF (Figura 4), observamos que αS/Tau441 coacerva en gran medida en solución, formando grandes gotas que entran en contacto e mollan a superficie na parte inferior do pozo/esvaporador como gotas completas, como se esperaba (Figura complementaria). . 7d);chamamos a estas estruturas formadas no fondo "balsas de proteínas".Estas estruturas permaneceron fluídas xa que conservaban a capacidade de fusionarse (figura complementaria 7b) e podían verse durante varias horas despois de que se activase o LLPS (figura 4 e figura complementaria 7c).Observamos que o proceso de humectación é favorecido na superficie de materiais hidrófilos en lugar de hidrófobos (figura complementaria 7a), como se esperaba para coacervados electrostáticos con cargas desequilibradas e, polo tanto, potenciais electrostáticos de superficie elevados.Notablemente, a coalescencia αS/ΔNt-Tau e o rafting reducíronse significativamente, mentres que os condensados ​​αS/pLK reducíronse significativamente (Fig. 4).Durante o curto tempo de incubación, as gotículas de αS/pLK puideron unirse e mollar a superficie hidrófila, pero este proceso detívose rapidamente e, tras 5 horas de incubación, só se observaron eventos de coalescencia limitados e non se observaron molladuras.- Transición xel-goteo.
BF (paneis en escala de grises) e CF (paneis da dereita, αS marcado con AF488 en verde) de mostras de coacervados que conteñen 100 µM αS (etiqueta fluorescente 1%) en tampón LLPS en presenza de imaxes microscópicas de 100 µM Tau441 (arriba) fluorescencia ΔN -Tau (centro) ou 1 mM pLK (inferior) a diferentes tempos de incubación e alturas focales (z, distancia do fondo do pozo da placa).Os experimentos repitéronse 4-6 veces de forma independente entre si cos mesmos resultados.Os coacervados de αS/Tau441 mollanse despois de 24 horas, formando balsas máis grandes que a imaxe.A barra de escala para todas as imaxes é de 20 µm.
Despois preguntamos se os grandes conxuntos de proteínas de tipo fluído formados en αS/Tau441 LLPS levarían á agregación de amiloide dalgunha das proteínas estudadas.Seguimos a maduración das gotas de αS/Tau441 ao longo do tempo con microscopía WF nas mesmas condicións que o anterior, pero usando αS marcado con AF488 1 μM e Tau441 marcado con Atto647N (Fig. 5a).Como era de esperar, observamos a localización completa das proteínas durante todo o proceso de maduración.Curiosamente, desde ca.Pasadas 5 horas observáronse no interior das bateas estruturas non circulares máis intensas, que chamamos “puntos”, algunhas das cales estaban colocalizadas con αS, e outras se enriquecían en Tau441 (Fig. 5a, frechas brancas).Estes puntos sempre se observaron dentro das balsas en maior medida para αS/ΔNt-Tau que para αS/ΔNt-Tau.Non había puntos distintos nas gotículas dos sistemas pLK e Tau incompetentes para a fusión/humectación.Para probar se estas manchas que conteñen αS e Tau441 son agregados semellantes ao amiloide, realizamos un experimento similar mediante microscopía CF no que Tau441 foi etiquetado con Atto647N e engadíronse 12,5 μM de tioflavina-T específica de amiloide (ThT) desde o principio.tintura.Aínda que non se observou a tinción con ThT de gotículas ou balsas de αS/Tau441 nin sequera despois de 24 h de incubación (Fig. 5b, fila superior: gotas restantes sobre as balsas de proteínas), as estruturas ThT positivas que contiñan Atto647N-Tau441 dentro das balsas eran moi débiles.isto replica o tamaño, a forma e a localización das manchas descritas anteriormente (Fig. 5b, filas media e inferior), o que suxire que as manchas poden corresponder a agregados de tipo amiloide formados en coacervados fluídos envellecidos.
WF 25 μM αS a varios tempos de incubación e alturas focales (z, distancia do fondo non unido) en presenza de 25 μM Tau441 (1 μM αS marcado con AF488 e Tau441 marcado con Atto647N) nun pozo dunha placa de microscopio con tampón LLPS) .Seis experimentos repitéronse de forma independente con resultados similares.b Imaxe microscópica CF de 25 μM αS en presenza de 25 μM de Tau441 (1 μM de Tau441 marcado con Atto647N) e 12,5 μM de tioflavina-T (ThT).As gotas de proteína ponderadas e as balsas e manchas de proteína depositadas móstranse nas filas superior e media, respectivamente.A fila inferior mostra imaxes de balsas e caídas de 3 réplicas independentes.As frechas brancas indican puntos ThT positivos nos dous paneis.A barra de escala para todas as imaxes é de 20 µm.
Para examinar con máis detalle os cambios na rede de proteínas coacervadas durante a transición de líquido a sólido, utilizamos imaxes de fluorescencia de por vida (FLIM) e microscopía de transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET) (Figura 6 e Figuras complementarias 8 e 9).Suxeitamos a hipótese de que a maduración coacervada da capa nunha estrutura de proteína agregada máis condensada ou incluso sólida leva a un contacto máis estreito entre a proteína e a sonda fluorescente unida a ela, producindo potencialmente un efecto de extinción que se manifesta nun período de vida útil reducido da sonda (τ). , como se describiu anteriormente40.,41,42.Ademais, para as mostras con dobre etiquetado (AF488 e Atto647N como colorantes doadores e aceptores de FRET, respectivamente), esta diminución de τ tamén pode ir acompañada de condensación de coacervados e un aumento da eficiencia de FRET (E) durante a LSPT.Monitorizamos a formación de balsas e puntos ao longo do tempo en mostras de LLPS αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau (25 µM de cada proteína en tampón LLPS que contén 1 µM AF488 marcado αS e/ou Atto647N marcado Tau441 ou ΔNt-Tau).Observamos unha tendencia xeral en que a vida útil de fluorescencia das sondas AF488 (τ488) e Atto647N (τ647N) diminuíu lixeiramente a medida que maduraban os coacervados (figura 6 e figura complementaria 8c).Curiosamente, este cambio foi significativamente mellorado para os puntos dentro das balsas (Fig. 6c), o que indica que se produciu máis condensación de proteínas en puntos.En apoio diso, non se observou ningún cambio significativo na vida útil da fluorescencia para as gotículas de αS/ΔNt-Tau envellecidas durante 24 h (Figura 8d complementaria), o que suxire que a xelación de gotas é un proceso distinto da mancha e que non vai acompañada dunha reorganización molecular significativa. dentro de coacervados.Nótese que os puntos teñen diferentes tamaños e contido variable en αS, especialmente para o sistema αS/Tau441 (figura complementaria 8e).A diminución da vida útil da fluorescencia puntual estivo acompañada dun aumento da intensidade, especialmente para Tau441 marcado con Atto647N (Figura complementaria 8a), e unha maior eficiencia FRET para os sistemas αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau, o que indica máis condensación en LLPS Cinco horas. despois de activarse, as proteínas dentro da electricidade estática condensáronse.En comparación con αS/ΔNt-Tau, observamos valores máis baixos de τ647N e algo máis altos de τ488 en puntos αS/Tau441, acompañados de valores FRET máis baixos e máis non homoxéneos.Posiblemente, isto pode estar relacionado co feito de que no sistema αS/Tau441, a abundancia de αS observada e esperada nos agregados é máis heteroxénea, moitas veces subestequiométrica en comparación con Tau, xa que o propio Tau441 tamén pode sufrir LLPS e agregación (Figura 8e complementaria) .Non obstante, o grao de coalescencia de gotas, formación de balsas e, sobre todo, agregación de proteínas dentro de coacervados líquidos é máximo cando están presentes tanto Tau441 como αS.
a Imaxes de microscopía de fluorescencia de por vida (FLIM) de αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau a 25 μM de cada proteína (1 μM de αS marcado con AF488 e 1 μM de Tau441 ou ΔNt-Tau marcado con Atto647N).As columnas mostran imaxes representativas de mostras de LLPS en diferentes tempos de maduración (30 min, 5 h e 24 h).O marco vermello mostra a rexión que contén puntos αS/Tau441.Os períodos de vida móstranse como barras de cores.Barra de escala = 20 µm para todas as imaxes.b Imaxe FLIM ampliada da área seleccionada, mostrada no cadro vermello do panel a.Os intervalos de vida móstranse usando a mesma escala de cores que no panel a.Barra de escala = 5 µm.c Histogramas que mostran AF488 (unido a αS) ou Atto647N (unido a Tau) para diferentes especies de proteínas (gotas-D-, balsa-R- e speckle-P) identificadas en imaxes FLIM gravadas para αS-) tempo de vida útil de distribucións de Tau441 e Mostras de coacervado de αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI para D, 29-44 ROI para R e 21-51 ROI para puntos).Os valores medios e medianos móstranse como cadrados amarelos e liñas negras dentro das caixas, respectivamente.Os límites inferior e superior da caixa representan o primeiro e o terceiro cuartiles, respectivamente, e os valores mínimos e máximos dentro do intervalo intercuartílico de 1,5 veces (IQR) móstranse como bigotes.Os valores atípicos móstranse como diamantes negros.A significación estatística entre pares de distribucións determinouse mediante unha proba t de dúas mostras, asumindo varianzas desiguais.Os valores p da proba t de dúas colas móstranse con asteriscos para cada par de datos comparados (* valor p > 0,01, ** valor p > 0,001, *** valor p > 0,0001, **** p-value > 0,00001), ns Indica negligibilidade (p-value > 0,05).Os valores p exactos indícanse na táboa complementaria 1 e os datos orixinais preséntanse como ficheiros de datos brutos.
Para demostrar aínda máis a natureza de tipo amiloide das manchas/agregados, tratamos mostras de coacervados sen manchas durante 24 horas con altas concentracións de NaCl (1 M), o que deu lugar á separación dos agregados dos coacervados de proteínas.Cando se observaron agregados illados (é dicir, unha solución dispersa de agregados) mediante microscopía de forza atómica (AFM), observamos unha morfoloxía predominantemente esférica cunha altura regular duns 15 nm, que tende a asociarse en condicións de alta concentración de sal, similar á o comportamento das fibrillas amiloides típicas debido ao forte efecto hidrófobo na superficie (nótese que as fibrillas normalmente teñen unha altura de ~ 10 nm) (Figura complementaria 10a).Curiosamente, cando os agregados illados foron incubados con ThT nun ensaio estándar de fluorescencia ThT, observamos un aumento dramático no rendemento cuántico de fluorescencia ThT, comparable ao observado cando o colorante foi incubado con fibrillas amiloides αS típicas (Figura complementaria 10b), o que suxire que os agregados coacervados conteñen estruturas de tipo amiloide..De feito, os agregados eran tolerantes a altas concentracións de sal pero sensibles ao cloruro de guanidina 4 M (GdnHCl), como as típicas fibrillas de amiloide (figura complementaria 10c).
A continuación, analizamos a composición dos agregados mediante fluorescencia de molécula única, espectroscopia de correlación/correlación cruzada de fluorescencia específica (FCS/FCCS) e análise de explosión de detección de coincidencias de dúas cores (TCCD).Para iso, illamos os agregados formados despois de 24 horas de incubación en mostras de LLPS de 100 μl que conteñen αS e Tau441 (ambos 25 μM) xunto con αS marcado con AF488 1 μM e Tau441 marcado con 1 μM Atto647N.Dilúese a solución de agregado disperso resultante ata un estado monomolecular usando o mesmo tampón libre de PEG e NaCl 1 M (o mesmo tampón que se usa para separar os agregados do coacervado) para evitar posibles interaccións electrostáticas entre LLPS e proteína.Na figura 7a pódese ver un exemplo da traxectoria temporal dunha soa molécula.A análise FCCS/FCS (correlación cruzada, CC e autocorrelación, AC) mostrou que os agregados que conteñen αS e tau eran abundantes nas mostras (ver a curva CC na figura 7b, panel esquerdo), e un exceso de proteína monomérica residual xurdiu como un resultado do proceso de dilución (ver curvas AC na Figura 7b, panel esquerdo).Os experimentos de control realizados nas mesmas condicións de solución usando mostras que conteñen só proteínas monoméricas non mostraron curvas CC, e as curvas AC encaixan ben co modelo de difusión dun compoñente (Ecuación 4), onde as proteínas monoméricas teñen os coeficientes de difusión esperados (Fig. 7b). ), panel dereito).O coeficiente de difusión das partículas agregadas é inferior a 1 µm2/s, e o das proteínas monoméricas é de aproximadamente 1 µm2/s.50–100 µm/s;Os valores son similares aos valores publicados anteriormente para as fibrillas amiloides αS sonicadas e as αS monoméricas por separado en condicións de solución similares44.Cando analizamos os agregados coa análise de explosión TCCD (Fig. 7c, panel superior), descubrimos que en cada agregado illado (heteroagregado αS/Tau), preto do 60% dos agregados detectados contiñan tanto αS como tau, preto do 30% só contiña tau, un 10% só de αS.A análise estequiométrica dos heteroagregados αS/Tau mostrou que a maioría dos heteroagregados estaban enriquecidos en tau (estequiometría inferior a 0,5, o número medio de moléculas de tau por agregado é 4 veces máis que as moléculas de αS), o que é consistente co noso traballo observado en FLIM in situ. experimentos..A análise FRET mostrou que estes agregados contiñan ambas proteínas, aínda que os valores reais de FRET neste caso non son de gran importancia, xa que a distribución de fluoróforos en cada agregado foi aleatoria debido ao exceso de proteína non marcada utilizada no experimento.Curiosamente, cando realizamos a mesma análise usando a variante Tau deficiente de agregación amiloide madura 45,46 (ver figura complementaria 11a, b), observamos que aínda que a agregación electrostática αS era a mesma (figura complementaria 11c, d). a capacidade de formar agregados dentro do coacervado reduciuse drasticamente e FLIM detectou varios puntos en experimentos in situ, e observáronse débiles curvas de correlación cruzada para mostras de agregados illados.Non obstante, para un pequeno número de agregados detectados (só unha décima parte de Tau441), observamos que cada agregado estaba enriquecido en αS que esta variante de Tau, con aproximadamente o 50% dos agregados detectados contén só moléculas de αS, e αS era heteroxéneo en exceso. .agregados (ver figura complementaria 11e), en contraste cos agregados heteroxéneos xerados por Tau441 (figura 6f).Os resultados destes experimentos mostraron que aínda que o propio αS é capaz de acumularse con tau dentro do coacervado, a nucleación de tau é máis favorable nestas condicións, e os agregados de tipo amiloide resultantes son capaces de actuar como unha forma de αS e tau.Non obstante, unha vez que se forma un núcleo rico en tau, as interaccións heterotípicas entre αS e tau son favorecidas nos agregados fronte ás interaccións homotípicas entre as moléculas de tau;tamén observamos redes de proteínas en coacervados líquidos αS/tau.
a Trazos temporais de fluorescencia representativos de moléculas individuais de agregados illados formados en coacervados electrostáticos αS/Tau441.Observáronse ráfagas correspondentes a coagregados αS/Tau441 (ráfagas por riba do limiar indicado) en tres canles de detección (emisión AF488 e Atto647N despois da excitación directa, liñas azuis e vermellas, emisión Atto647N despois da excitación indirecta), FRET, liña violeta).b Análise FCS/FCCS dunha mostra de agregados illados αS/Tau441 obtidos a partir de LLPS (panel esquerdo).As curvas de autocorrelación (AC) para AF488 e Atto647N móstranse en azul e vermello, respectivamente, e as curvas de correlación cruzada (CC) asociadas aos agregados que conteñen ambos os colorantes móstranse en vermello.As curvas AC reflicten a presenza de especies proteicas monoméricas e agregadas marcadas, mentres que as curvas CC mostran só a difusión de agregados dobre marcados.A mesma análise, pero nas mesmas condicións de solución que en puntos illados, as mostras que conteñen só αS e Tau441 monómeros móstranse como controis no panel dereito.c Análise flash de fluorescencia de moléculas individuais de agregados illados formados en coacervados electrostáticos αS/Tau441.A información para cada agregado que se atopa en catro repeticións diferentes (N = 152) traza a súa estequiometría, os valores S e a eficiencia FRET (panel superior, a barra de cores reflicte a aparición).Pódense distinguir tres tipos de agregados: agregados -αS só con S~1 e FRET~0, agregados só Tau con S~0 e FRET~1 e agregados heteroxéneos Tau/αS con S e FRET intermedios. Estimacións da cantidade. de ambas as proteínas marcadoras detectadas en cada agregado heteroxéneo (N = 100) móstranse no panel inferior (a escala de cores reflicte a aparición).Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
A maduración ou o envellecemento dos condensados ​​de proteínas líquidas en estruturas sólidas ou similares ao xel ao longo do tempo informouse de estar implicado en varias funcións fisiolóxicas do condensado47, así como na enfermidade, como un proceso anormal que precede á agregación de amiloide 7, 48, 49. Aquí estudamos a separación de fases e o comportamento en detalle.LSPT αS en presenza de policationes aleatorios nun ambiente controlado a baixas concentracións micromolares e condicións fisioloxicamente relevantes (nótese que a concentración fisiolóxica calculada de αS é > 1 µM50), seguindo o comportamento termodinámico típico do LPS.Descubrimos que αS, que contén unha rexión C-terminal altamente cargada negativamente a pH fisiolóxico, é capaz de formar gotas ricas en proteínas en solución acuosa mediante LLPS en presenza de péptidos desordenados altamente catiónicos como pLK ou Tau mediante o proceso de electrostática. condensación complexa en presenza de macromoléculas de agregación.Este proceso pode ter efectos relevantes no medio celular onde αS atopa varias moléculas policatiónicas asociadas á súa agregación asociada á enfermidade tanto in vitro como in vivo51,52,53,54.
En moitos estudos, a dinámica das proteínas dentro das gotículas considerouse como un dos factores clave que determinan o proceso de maduración55,56.Nos coacervados electrostáticos de αS con policationes, o proceso de maduración depende aparentemente da forza das interaccións cos policationos, da valencia e da multiplicidade destas interaccións.A teoría do equilibrio suxire que unha paisaxe de equilibrio de dous estados líquidos sería a presenza dunha gran gotita rica en biopolímeros que impulsan LLPS57,58.O crecemento das gotículas pódese conseguir mediante a maduración de Ostwald59, a coalescencia60 ou o consumo de monómero libre na fase dispersa61.Para αS e Tau441, ΔNt-Tau ou pLK, a maior parte da proteína concentrouse no condensado nas condicións utilizadas neste estudo.Non obstante, aínda que as gotículas de tau de tamaño completo uníronse rapidamente ao mollar a superficie, a coalescencia e a humectación das gotas foron difíciles para ΔNt-Tau e pLK, o que suxire unha rápida perda de propiedades líquidas nestes dous sistemas.Segundo a nosa análise FLIM-FRET, as gotículas de pLK e ΔNt-Tau envellecidas mostraron un grao de agregación de proteínas similar (tempo de vida de fluorescencia similar) ao das gotículas orixinais, o que suxire que se mantivo a rede de proteínas orixinal, aínda que máis ríxida.
Racionalizamos os nosos resultados experimentais no seguinte modelo (Figura 8).As gotículas formadas temporalmente son moitas veces redes de proteínas sen compensación electrostática e, polo tanto, hai áreas de desequilibrio de carga, especialmente na interface das gotas, o que orixina gotas cun alto potencial electrostático de superficie.Para compensar a carga (un fenómeno denominado habitualmente esgotamento da valencia) e minimizar o potencial superficial das gotículas, as gotículas poden incluír novos polipéptidos da fase diluída, reorganizar as redes de proteínas para optimizar as interaccións carga-carga e interactuar con outras gotas.con superficies (humectación).As gotículas de αS/pLK, debido á súa rede de proteínas máis sinxelas (só interaccións heterotípicas entre αS e pLK) e unha maior afinidade polas interaccións proteína-proteína, parecen ser capaces de equilibrar a carga do condensado máis rapidamente;de feito, observamos unha cinética proteica máis rápida nos coacervados de αS/pLK formados inicialmente que en αS/Tau.Despois do esgotamento da valencia, as interaccións vólvense menos efémeras e as gotículas perden as súas propiedades líquidas e convértense en gotas tipo xel, non inflamables, cun baixo potencial electrostático de superficie (e polo tanto incapaces de mollar a superficie).Pola contra, as gotículas αS/Tau son menos eficientes para optimizar o equilibrio de carga das gotas debido a redes de proteínas máis complexas (con interaccións homotípicas e heterotípicas) e á natureza máis débil das interaccións proteicas.Isto dá como resultado gotículas que manteñen o comportamento do líquido durante períodos prolongados de tempo e presentan un alto potencial electrostático de superficie que tende a minimizarse coa coalescencia e o crecemento (minimizando así a relación superficie/volume das gotículas) e mollando a química da superficie hidrófila.Isto crea grandes bibliotecas de proteínas concentradas que conservan as propiedades do fluído xa que as interaccións seguen sendo moi transitorias debido á busca constante de optimización de carga na rede de proteínas.Curiosamente, as formas de Tau truncadas no extremo N-terminal, incluíndo algunhas isoformas naturais62, presentan un comportamento intermedio, con algúns coacervados envelleciendo con αS en gotículas tipo xel de longa duración, mentres que outros transfórmanse en grandes condensados ​​líquidos.Esta dualidade na maduración dos coacervados electrostáticos αS é consistente cos estudos teóricos e experimentais recentes de LLPS que identificaron unha correlación entre o esgotamento da valencia e o tamizado electrostático nos condensados ​​como clave para controlar o tamaño do condensado e as propiedades do fluído.Mecanismo 58.61.
Este esquema mostra a vía de agregación de amiloide suposta para αS e Tau441 a través de LLPS e LSPT.Con rexións adicionais ricas en anións (vermello) e ricas en cationes (azul), os coacervados electrostáticos αS e tau cunha valencia satisfactoria teñen menor enerxía superficial e, polo tanto, menos coalescencia, o que provoca un rápido envellecemento das gotas.Conséguese un estado de xel non aglomerado estable..Esta situación é moi favorable no caso do sistema αS/pLK debido á súa maior afinidade e á súa rede de interacción proteína-par máis sinxela, o que permite unha rápida transición tipo xel.Pola contra, as gotículas con valencia insatisfactoria e, polo tanto, rexións cargadas de proteínas dispoñibles para a interacción, facilitan que o coacervado se fusione e molle a superficie hidrófila co fin de reducir a súa elevada enerxía superficial.Esta situación é preferible para os coacervados αS/Tau441, que teñen unha rede complexa multivalente formada por interaccións débiles Tau-Tau e αS-Tau.Á súa vez, os coacervados máis grandes conservarán máis facilmente as súas propiedades de fluído, permitindo que se produzan outras interaccións proteína-proteína.Finalmente, no fluído coacervado fórmanse agregados heteroxéneos amiloides que conteñen tanto αS como tau, que poden estar relacionados cos que se atopan nos corpos de inclusión, que son selos distintivos das enfermidades neurodexenerativas.
As grandes estruturas similares a fluídos formadas durante a maduración de αS/Tau441 cun ambiente proteico moi conxestionado pero dinámico e, en menor medida, os coacervados αS/ΔNt-Tau son reservorios ideais para a nucleación da agregación proteica.De feito, observamos a formación de agregados de proteínas sólidas neste tipo de coacervados de proteínas, que a miúdo conteñen tanto αS como tau.Demostramos que estes heteroagregados están estabilizados por interaccións non electrostáticas, son capaces de unirse a colorantes ThT específicos de amiloide do mesmo xeito que as fibrillas amiloides típicas e, de feito, teñen unha resistencia similar a varias influencias.Demostrouse que os agregados αS/tau formados por LLPS teñen propiedades de tipo amiloide.De feito, a variante madura de Tau deficiente na agregación de amiloide está significativamente prexudicada na formación destes agregados heteroxéneos de αS dentro do coacervado electrostático líquido.A formación de agregados αS/Tau441 observouse só no interior dos coacervados, que conservaban propiedades similares a líquidos, e nunca, se os coacervados/gotas non alcanzaban o estado de xel.Neste último caso, o aumento da forza das interaccións electrostáticas e, como resultado, a rixidez da rede de proteínas impiden os necesarios reordenamentos conformacionais das proteínas para establecer novas interaccións proteicas necesarias para a nucleación do amiloide.Non obstante, isto pódese conseguir en coacervados máis flexibles e similares a líquidos, que á súa vez teñen máis probabilidades de permanecer líquidos a medida que aumentan de tamaño.
O feito de que a formación de agregados dentro da fase condensada sexa preferible en grandes condensados ​​αS/Tau que en pequenas gotas que se xelan rapidamente, destaca a relevancia de identificar os factores que controlan a coalescencia das gotas.Así, non só hai unha tendencia á separación de fases, senón que o tamaño do condensado debe ser controlado para un bo funcionamento así como para a prevención de enfermidades58,61.Os nosos resultados tamén destacan a importancia do equilibrio entre LLPS e LSPT para o sistema αS/Tau.Aínda que a formación de gotículas pode protexer contra a agregación de amiloide ao reducir a cantidade de monómeros proteicos dispoñibles en condicións de saturación, como se propuxo noutros sistemas63,64, a fusión de gotículas a niveis elevados de gotículas pode levar á agregación interna de proteínas mediante reordenacións conformacionais lentas.redes de proteínas..
En xeral, os nosos datos enfatizan moito a relevancia da valencia cohesionada e as interaccións satisfeitas/insatisfeitas nas redes de caída no contexto da LSPT.En particular, mostramos que os condensados ​​αS/Tau441 de lonxitude total son capaces de fusionarse e nuclearse de forma eficiente para formar heteroagregados de tipo amiloide que inclúen ambas proteínas e propoñen un mecanismo molecular baseado nos nosos resultados experimentais.A co-agregación de dúas proteínas no coacervado do fluído αS/Tau que informamos aquí pode estar relacionada coa co-localización de dúas proteínas en inclusións, que son características da enfermidade, e pode contribuír a comprender a relación entre LLPS e agregación de amiloide, allanando o camiño para o IDP altamente cargado na neurodexeneración.
En E. coli expresáronse e purificáronse como se describiu anteriormente WT-αS, mutantes de cisteína (Q24C-αS, N122C-αS) e variantes ΔCt-αS (Δ101-140).5 mM DTT incluíuse en todos os pasos da purificación de mutantes de cisteína αS para evitar a formación de enlaces disulfuro.A isoforma Tau441 (plásmido obtido a partir de Addgene #16316), a variante ΔNt-Tau (Δ1–150, obtida mediante a clonación de IVA con cebadores CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) e a variante AggDef-Tau-Tau purificada con cultivos G31TC, ΔGC 75 con cebadores (G31127). creceu ata OD600 = 0,6-0,7 a 37 °C e 180 rpm, e a expresión foi inducida con IPTG durante 3 horas a 37 °C.Recolle células a 11.500 xg durante 15 min a 4 °C e lave con solución salina que conteña NaCl 150 mM.Resuspender o sedimento en tampón de lise (20 ml por 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, copeptina μM100).O paso de sonicación realizouse en xeo cunha amplitude do 80% durante 10 pulsos (1 min encendido, 1 min apagado).Non supere os 60 ml nunha ecografía.Os lisados ​​de E. coli quentáronse a 95 °C durante 20 minutos, despois arrefriáronse en xeo e centrifugáronse a 127.000 xg durante 40 minutos.O sobrenadante clarificado aplicouse a unha membrana de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) e se dializou contra 4 L de tampón de diálise (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) durante 10 horas.Unha columna de intercambio catiónico de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, EUA) foi equilibrada con tampón de equilibrio (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).O lisado de tau filtróuse a través dun filtro de PVDF de 0,22 μm e inxectouse na columna a un caudal de 1 ml/min.A elución realizouse gradualmente, tau eluíuse cun tampón de elución do 15-30% (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).As fraccións foron analizadas mediante SDS-PAGE, e todas as fraccións que conteñan unha banda co peso molecular esperado de tau concentráronse usando un filtro de centrífuga de 10 kDa e substituíronse por un tampón que contiña HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e DTT 2 mM para a concentración final de proteína foi de 100 μM.A disolución de proteína pasou entón a través dun filtro de PVDF de 0,22 μm, conxelouse rapidamente e almacenouse a -80 °C.A proteína K18 foi proporcionada polo profesor Alberto Boffi.A pureza da preparación foi > 95% segundo confirmaron SDS-PAGE e MALDI-TOF/TOF.Varias cisteínas foron marcadas químicamente con AlexaFluor488-maleimida (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) ou TEMPOL-maleimida (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá).foron confirmados por absorbancia e MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau e K18 foron etiquetados con residuos de cisteína nativos nas posicións 191 e 322 usando Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemaña) seguindo o mesmo procedemento.Os mapas de carga neta por residuo para αS e Tau441 foron xerados usando CIDER66.
Poli-L-lisina sólida (pLK DP 90-110 segundo RMN do provedor, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, EUA) foi disolta en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, concentración de pH 7,4 a 10 mM, proceso sonicado durante 5 minutos nun baño de ultrasóns e almacénase a -20 °C.PEG-8, dextrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, EUA) e FITC-dextrano-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, EUA) son solubles en auga e están amplamente distribuídos no tampón LLPS.A diálise elimina sales contaminantes.Despois filtráronse a través dun filtro de xiringa cun tamaño de poro de 0,22 μm e calculáronse as súas concentracións mediante un refractómetro (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU.).As mostras de LLPS preparáronse a temperatura ambiente na seguinte orde: mesturáronse o tampón e a extrusión e 1 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, Reino Unido), 1 mM de 2,2,2,2-(etano). 1, 2-diildinitrilo) ácido tetraacético (EDTA, carboxinto) e unha mestura de inhibidor de protease ao 1 % (PMSF 100 mM, bencimida 1 mM, leupeptina 5 μM).Despois engádense αS e policationes fusionados (opcións pLK ou Tau).Para experimentos de series temporais de tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Reino Unido), use a concentración total de ThT para que sexa a metade da concentración de αS.Mestura suavemente pero ben as mostras para garantir que sexan homoxéneas.A concentración de cada compoñente variou dun experimento a outro, como se describe na sección Resultados.Utilizouse azida nunha concentración do 0,02% (p/v) sempre que a duración do experimento superou as 4 horas.Para todas as análises que utilicen mostras de LLPS, deixe que a mestura se equilibre durante 5 minutos antes da análise.Para a análise da dispersión da luz, cargáronse 150 µl de mostras en microplacas de 96 pocillos non vinculantes (µClear®, negro, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) e cubriuse cunha película adhesiva.Os LLP foron monitorizados medindo a absorbancia a 350 nm no centro da solución nun lector de placas CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemaña).Os experimentos realizáronse por triplicado a 25 °C, e os erros calculáronse como a desviación estándar da media.A fase diluída cuantificouse mediante centrifugación da mostra e análise de xel SDS-PAGE, e a fracción αS nas fases diluída e concentrada cuantificouse en varias solucións de LLPS.Preparouse unha mostra de LLPS de 100 μl que contiña αS marcado con AF488 1 μM mediante unha mestura completa seguida de centrifugación a 9600 × g durante 30 minutos, despois do cal o precipitado adoita ser visible.Os 50 μl superiores do sobrenadante utilizáronse para a cuantificación de proteínas mediante xel SDS-PAGE.Os xeles foron dixitalizados con filtros AF488 usando un sistema de imaxe en xel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) ou tinguiuse con tinción Coomassie e visualizáronse cos filtros axeitados.As bandas resultantes analizáronse mediante ImageJ versión 1.53i (National Institutes of Health, EUA).Os experimentos realizáronse por duplicado en dous experimentos diferentes con resultados similares.
Normalmente, aplicáronse 150 μl de mostras a microplacas de 96 pocillos non vinculantes e visualizáronse a temperatura ambiente nun microscopio invertido Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemaña).Para experimentos puntuales, tamén se utilizaron placas de anxioxénese µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemaña) ou microplacas de poliestireno de 96 pocillos (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Utilizáronse lámpadas halóxenas EL6000 ou halogenuros metálicos de mercurio como fontes de iluminación (para imaxes BF/DIC e WF, respectivamente).Para a microscopía WF, utilizouse un obxectivo de aire de aumento de 40x (Leica Microsystems, Alemaña) para enfocar a luz na mostra e recollela.Para as mostras marcadas con AF488 e ThT, filtros de excitación e emisión con conxuntos de filtros GFP estándar, filtros pasabanda de excitación e emisión, respectivamente, filtros pasabanda de 460-500 nm e 512-542 nm e un espello dicroico de 495 nm.Para as mostras etiquetadas con Atto647N, utilizouse un conxunto estándar de filtros Cy5 con filtros pasabanda de excitación e emisión de 628-40 nm e 692-40 nm, respectivamente, e un espello dicroico de 660 nm.Para microscopía BF e DIC, use o mesmo obxectivo de recollida de luz reflectida.A luz recollida foi gravada nunha cámara CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Alemaña).O tempo de exposición foi de 50 ms para imaxes de microscopía BF e DIC e de 20-100 ms para imaxes de microscopía WF.Para comparación, o tempo de exposición para todos os experimentos con ThT foi de 100 ms.Realizáronse experimentos de lapso de tempo para visualizar a coalescencia das gotas, recollendo imaxes cada 100 ms durante varios minutos.Utilizouse ImageJ (NIH, EUA) para a análise de imaxes.Os experimentos realizáronse por triplicado con resultados similares.
Para experimentos de colocalización, FRAP e reconstrución 3D, as imaxes foron adquiridas nun microscopio confocal invertido Zeiss LSM 880 usando unha edición azul ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemaña).Aplicáronse mostras de 50 µl a placas Petri de angioxénese µ-Slide (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemaña), tratadas cun polímero hidrófilo (ibiTreat) e montadas nun obxectivo de inmersión en aceite 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) en DIC).As imaxes foron adquiridas mediante liñas de láser de argón de 458 nm, 488 nm e 633 nm cunha resolución de 0,26 µm/píxel e un tempo de exposición de 8 µs/píxel para fiestras de detección de excitación e emisión de 470-600 nm, 493-628 nm. e 638–755 nm utilizáronse para visualizar ThT, AF488 e Atto647N, respectivamente.Para os experimentos FRAP, a fotografía de lapso de tempo de cada mostra foi rexistrada a 1 fotograma por segundo.Os experimentos realizáronse por triplicado a temperatura ambiente con resultados similares.Todas as imaxes foron analizadas mediante o software Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemaña).As curvas FRAP normalizáronse, trazáronse e axustáronse aos datos de intensidade/tempo extraídos de imaxes usando Zen 2 usando OriginPro 9.1.As curvas de recuperación axustáronse a un modelo mono-exponencial para ter en conta a difusión molecular cun termo exponencial adicional para explicar o efecto de branqueamento da adquisición.Despois calculamos D usando o radio de branqueamento nominal e a vida media de recuperación previamente determinada como na ecuación de Kang et al.5 35 mostrado.
Sintetizáronse variantes de cisteína única de αS con 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxilo (TEMPOL) nas posicións 24 (TEMPOL-24-αS) e 122 (TEMPOL-122-αS), respectivamente.Etiquetaxe de spin Para os experimentos de EPR, a concentración de αS estableceuse en 100 μM e a concentración de PEG foi do 15% (p/v).Para varias condicións de agregación, a relación αS:pLK foi de 1:10, mentres que as proporcións αS:ΔNt-Tau e αS:Tau441 mantivéronse en 1:1.Para os experimentos de titulación de unión en ausencia de aglomeración, TEMPOL-122-αS mantívose a 50 μM e os policationos tittáronse a concentracións crecentes, preparando cada condición por separado.As medicións CW-EPR realizáronse utilizando un espectrómetro de banda X Bruker ELEXSYS E580 equipado cun resonador Bruker ER4118 SPT-N1 que funciona a unha frecuencia de microondas (SHF) de ~9,7 GHz.A temperatura foi establecida en 25 °C e controlada por un criostato de nitróxeno líquido.Os espectros obtivéronse en condicións insaturadas cunha potencia de MW de 4 mW, unha amplitude de modulación de 0,1 mT e unha frecuencia de modulación de 100 kHz.Normalizáronse as intensidades espectrais para evitar diferenzas nas concentracións de espín entre as mostras e unha posible redución de espín debido ás concentracións residuais de axentes redutores en mostras que conteñen Tau441 ou ΔNt-Tau (presentes nas solucións de proteínas orixinais).Os valores dados de g obtivéronse como resultado do modelado espectral EPR realizado mediante o software Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementado en Matlab®67.Utilizáronse modelos isotrópicos de un ou dous compoñentes para modelar os datos.Despois de normalizar todos os sinais, calculáronse os residuos restando cada simulación do espectro experimental correspondente.Para a análise de titulación de unión, utilizouse a intensidade relativa da terceira banda á segunda banda do espectro EPR normalizado (IIII/III) para controlar a unión dos policationes a αS.Para estimar a constante de disociación (Kd), a curva resultante axustouse a un modelo aproximado asumindo n sitios de unión idénticos e independentes.
Os experimentos de espectroscopia de RMN realizáronse utilizando un espectrómetro de RMN Bruker Neo 800 MHz (1H) equipado cunha criosonda e gradiente Z.Todos os experimentos realizáronse utilizando αS 130-207 µM e os correspondentes equivalentes de αS/ΔNt-Tau e pLK en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, DO 10%, pH 7,4 e realizáronse a 15 °C.Para controlar o LPS mediante RMN, engadiuse un 10% de PEG ás mostras premesturadas.O gráfico de perturbación do desprazamento químico (Fig. 1b) mostra os desprazamentos químicos medios de 1H e 15N.Os espectros αS 2D1H-15N HSQC asignáronse en función dunha asignación anterior (entrada BMRB #25227) e confirmáronse gravando e analizando os espectros 3D de HNCA, HNCO e CBCAcoNH.Calculáronse os desprazamentos químicos 13Cα e 13Cβ en presenza de ΔNt-Tau ou pLK para medir posibles cambios nas tendencias da estrutura secundaria en comparación cos desprazamentos químicos αS na conformación de bobina aleatoria pura 68 (Figura complementaria 5c).As taxas de R1ρ medironse gravando experimentos hsqctretf3gpsi (obtidos da biblioteca Bruker) con atrasos de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 e 800 ms, e as funcións exponenciais axustáronse aos atrasos de intensidade máxima a diferentes intensidades. veces para determinar o R1ρ e a súa incerteza experimental.
Realizáronse experimentos de microscopía de fluorescencia con resolución temporal de dúas cores nun microscopio confocal de fluorescencia MT200 con resolución temporal comercial (PicoQuant, Berlín, Alemaña) cun dispositivo de conteo de fotóns únicos correlacionado co tempo (TCSPC).O cabezal de díodo láser utilízase para a excitación intercalada pulsada (PIE), o feixe atravesa unha guía de ondas de modo único e está sintonizado cunha potencia de láser de 10 a 100 nW para liñas láser de 481 nm e 637 nm medidas despois dun espello dicroico.Isto garante unha taxa de reconto de fotóns óptima, evitando os efectos do aliasing de fotóns, o fotobranqueamento e a saturación.Os cubreobjetos ou placas de anxioxénese μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemaña) colocáronse directamente en auga de inmersión sobre unha lente Super Apochromat 60x NA 1.2 cun colar corrector (Olympus Life Sciences, Waltham, EUA).Utilizouse un espello dicroico de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) como divisor de feixe principal.A radiación non enfocada está bloqueada por un orificio cun diámetro de 50 micras, a continuación, a radiación enfocada divídese en 2 camiños de detección por un divisor de feixe 50/50.Diante do detector utilizáronse filtros de emisión de paso de banda (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) 520/35 para o colorante verde (AF488) e 690/70 para o tinte vermello (Atto647N).Como detectores utilizáronse díodos de avalancha de fotón único (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia).Tanto a recollida como a análise de datos realizáronse mediante o software SymphoTime64 dispoñible comercialmente (PicoQuant GmbH, Berlín, Alemaña).
Aplicáronse cincuenta microlitros de mostras de LLPS a pozos de anxioxénese μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemaña).As imaxes resultantes céntranse a 20 µm por riba do fondo do pozo para obter unha distancia de traballo óptima do obxectivo para as gotas suspendidas e a ~1 µm para as balsas e puntos cunha resolución axial de polo menos 0,25 µm/píxel e un tempo de retardo de 400 µs/píxel.Seleccione os datos aplicando un limiar de intensidade baseado na intensidade media do sinal de fondo (PBG, media + 2σ) para cada canle de modo que só se seleccionen gotas de proteína líquida, balsas ou puntos, filtrando calquera orixe posible da fase dispersa.Para analizar a vida útil de cada especie (τ) de cada canle (verde, "g" para AF488 e vermello, "r" para Atto647N), seleccionamos rexións de interese (ROI) que conteñan gotas, balsas ou puntos (Figura complementaria 1). ).8b) e derivounos axustando a súa desintegración durante toda a súa vida útil (τD, τR e τP para gotículas, balsas ou puntos, respectivamente, consulte a figura complementaria 8c) en cada canle mediante unha análise de axuste da cola e un modelo de desintegración de dous compoñentes.Media τ a partir de τ .Excluíronse da análise os ROI que producían moi poucos fotóns para un axuste multi-exponencial.O corte empregado foi <104 fotóns para balsas e puntos e 103 para gotas.As gotículas teñen un limiar máis baixo porque é difícil obter curvas de desintegración con valores de intensidade máis altos, xa que as gotículas no campo da imaxe adoitan ser máis pequenas e menos numerosas.Tamén se descartaron para a análise os ROI con recontos de fotóns por riba do límite de acumulación de fotóns (establecido en > 500 contas/píxel).Relacione a curva de decaimento de intensidade obtida da rexión de interese cunha intensidade ao 90 % da máxima (lixeiramente despois da intensidade máxima da desintegración) desde o inicio da vida útil para garantir a mínima interferencia IRF mantendo a mesma para toda a intensidade de decaimento. configuracións Fiestra de tempo relativo Analizáronse de 25 a 50 ROI para balsas e spots e 15-25 ROI para gotas, imaxes seleccionadas entre máis de 4 réplicas rexistradas de polo menos 3 experimentos independentes.Utilizáronse probas t de dúas colas para avaliar diferenzas estatísticas entre especies ou entre sistemas de coacervados.Para unha análise píxel por píxel do tempo de vida (τ), calculouse a atenuación total do tempo de vida sobre o campo para cada canle e realizouse unha aproximación dun modelo de atenuación exponencial de 2/3 compoñentes.A atenuación da vida útil para cada píxel foi entón axustada usando valores τ calculados previamente, dando como resultado unha imaxe de axuste FLIM de pseudocor.O intervalo de vida útil do axuste da cola foi o mesmo en todas as imaxes da mesma canle, e cada desintegración produciu suficientes fotóns para proporcionar un axuste fiable.Para a análise FRET, seleccionáronse os píxeles aplicando un limiar de intensidade máis baixo de 100 fotóns, que fixo unha media dun sinal de fondo (FBG) de 11 fotóns.A intensidade de fluorescencia de cada canle foi corrixida mediante factores de corrección determinados experimentalmente: 69 a diafonía espectral α foi de 0,004, a excitación directa β foi de 0,0305, a eficiencia de detección γ foi de 0,517.A eficiencia FRET a nivel de píxeles calcúlase entón mediante a seguinte ecuación:
onde FDD é a intensidade de fluorescencia observada na canle doante (verde), FDA é a intensidade de fluorescencia observada na canle aceptora (vermello) baixo excitación indirecta e FAA é a intensidade de fluorescencia observada na canle aceptora (vermello) baixo excitación directa. TORTA).Obsérvanse pulsos de intensidade de fluorescencia na canle).
Coloque 100 µl de solucións de reacción LLPS que conteñan 25 µM de Tau441 monomérico sen marcar (con ou sen 25 µM αS) en tampón LLPS (complementado como anteriormente) en microplacas de 96 pocillos sen unión con recubrimento de folla adhesiva e comprobouse a formación de gotas mediante microscopía WF. equilibrio.dentro de 10 min.Despois de 48 horas de incubación a temperatura ambiente, confirmouse a presenza de balsas e manchas proteicas.A continuación, retire coidadosamente o líquido sobre as balsas dos pozos, despois engade 50 L de tampón de disociación (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, DTT 1 mM) e incube durante 10 min.A alta concentración de sal garante que o LLPS non se repita debido ao PEG residual e desmontaranse os posibles conxuntos de proteínas formados só por interaccións electrostáticas.O fondo do pozo foi despois coidadosamente raspado cunha punta de micropipeta e a solución resultante foi transferida a un pozo de observación baleiro.Despois da incubación das mostras con 50 μM ThT durante 1 h, comprobouse a presenza de puntos illados mediante microscopía WF.Prepare fibrillas αS sonicadas incubando 300 µl dunha solución αS de 70 µM en PBS con pH 7,4, azida de sodio 0,01% a 37 °C e 200 rpm nun agitador orbital durante 7 días.Despois centrifugouse a solución a 9600 × g durante 30 min, o pellet volveuse a suspender en PBS pH 7,4 e sometírase a mostras de fibrillas (1 min, ciclo do 50 %, amplitude do 80 % nun sonicador Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, EUA). cunha distribución de tamaño relativamente uniforme de fibrillas pequenas.
Realizáronse análises FCS/FCCS e detección de coincidencias de dúas cores (TCCD) no mesmo microscopio confocal fluorescente MT200 resolto no tempo (Pico-Quant, Berlín, Alemaña) que se utilizou para os experimentos de microscopía FLIM-FRET usando o modo PIE.A potencia do láser para estes experimentos engadiuse a 6,0 µW (481 nm) e 6,2 µW (637 nm).Elixiuse a combinación destas potencias de láser para producir un brillo similar para os pares de fluoróforos utilizados ao mesmo tempo que se logran taxas de reconto óptimas e se evitan o fotobranqueamento e a saturación.Tanto a recollida como a análise de datos realizáronse mediante o software SymphoTime64 versión 2.3 dispoñible comercialmente (PicoQuant, Berlín, Alemaña).
As mostras de agregados αS/Tau illados obtidos mediante LLPS dilúense nun tampón de illamento ata a concentración monomolecular adecuada (normalmente unha dilución 1:500, xa que os agregados xa están en concentracións baixas cando se illan das mostras de coacervados).As mostras aplicáronse directamente sobre cubreobjetos (Corning, EE. UU.) revestidos previamente cunha solución de BSA a unha concentración de 1 mg/mL.
Para a análise PIE-smFRET nas canles verde e vermella, aplicouse un limiar de intensidade máis baixo de 25 fotóns para filtrar os sinais de baixa intensidade causados ​​por eventos monoméricos (nótese que os monómeros superan en número ás mostras agregadas en comparación cos agregados illados).Este limiar calculouse como cinco veces a intensidade media do αS monomérico obtido da análise de mostras de monómeros puros para seleccionar especificamente os agregados para a súa análise.O circuíto de accionamento PIE, xunto coa adquisición de datos TSCPC, permitiu a aplicación dun filtro de ponderación de por vida que axuda a eliminar a diafonía de fondo e espectral.A intensidade de flare seleccionada utilizando os limiares anteriores foi corrixida mediante o sinal medio de fondo determinado a partir dos histogramas de aparición fronte á intensidade/bineiro das mostras só de tampón.As ráfagas asociadas a grandes agregados normalmente ocupan varias caixas consecutivas no trazo temporal (establecido en 1 ms).Nestes casos, escolleuse un colector de máxima resistencia.Para a análise FRET e estequiométrica, utilizouse o factor gamma γ (0,517) determinado teoricamente.A diafonía espectral e as contribucións de excitación directa son insignificantes (determinadas experimentalmente) na potencia do láser de excitación utilizada.A eficiencia e a estequiometría de FRET nunha explosión calcúlase do seguinte xeito.