Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Control deslizante que mostra tres artigos por diapositiva.Usa os botóns atrás e seguinte para moverte polas diapositivas ou os botóns do controlador de diapositivas ao final para moverte por cada diapositiva.

Provedores de tubos de bobina de aceiro inoxidable 317

Táboa de composición química do material de aceiro inoxidable

SPACA6 é unha proteína de superficie expresada polo esperma que é fundamental para a fusión de gametos durante a reprodución sexual dos mamíferos.A pesar deste papel fundamental, a función específica de PACA6 é pouco entendida.Elucidamos a estrutura cristalina do dominio extracelular de SPACA6 cunha resolución de 2,2 Å, revelando unha proteína de dous dominios composta por un feixe de catro cadeas e bocadillos β semellantes a Ig unidos por ligadores case flexibles.Esta estrutura aseméllase a IZUMO1, outra proteína asociada á fusión de gametos, o que fai que SPACA6 e IZUMO1 sexan membros fundadores da superfamilia de proteínas asociadas á fertilización denominada aquí superfamilia IST.A superfamilia IST defínese estruturalmente polo seu feixe de catro hélices retorcidas e un par de motivos CXXC ligados por disulfuro.Unha busca AlphaFold baseada na estrutura do proteoma humano identificou membros de proteínas adicionais desta superfamilia;notablemente, moitas destas proteínas están implicadas na fusión de gametos.A estrutura de SPACA6 e a súa relación con outros membros da superfamilia IST proporcionan o elo que falta no noso coñecemento da fusión de gametos de mamíferos.
Toda vida humana comeza con dous gametos haploides separados: o esperma do pai e o óvulo da nai.Este espermatozoide é o gañador dun intenso proceso de selección durante o cal millóns de espermatozoides pasan polo tracto xenital feminino, superan diversos obstáculos1 e experimentan capacitación, o que potencia a súa motilidade e o proceso dos compoñentes da superficie2,3,4.Aínda que o esperma e o ovocito se atopen, o proceso aínda non rematou.O ovocito está rodeado por unha capa de células cúmulos e unha barreira de glicoproteínas chamada zona pelúcida, pola cal deben pasar os espermatozoides para entrar no ovocito.Os espermatozoides usan unha combinación de moléculas de adhesión á superficie e encimas secretadas e asociadas á membrana para superar estas barreiras finais5.Estas moléculas e encimas almacénanse principalmente na membrana interna e na matriz acrosomal e detéctanse cando a membrana externa do esperma se lisa durante a reacción acrosómica6.O paso final desta intensa viaxe é o evento de fusión espermatozoide-óvulo, no que as dúas células fusionan as súas membranas para converterse nun único organismo diploide7.Aínda que este proceso é innovador na reprodución humana, as interaccións moleculares necesarias son pouco entendidas.
Ademais da fertilización de gametos, estudouse amplamente a química da fusión de dúas bicapas lipídicas.En xeral, a fusión de membranas é un proceso enerxeticamente desfavorable que require que un catalizador proteico experimente un cambio de conformación estrutural que aproxime dúas membranas, rompendo a súa continuidade e provocando a fusión8,9.Estes catalizadores proteicos coñécense como fusóxenos e atopáronse en innumerables sistemas de fusión.Son necesarios para a entrada viral nas células hóspedes (por exemplo, gp160 no VIH-1, pico en coronavirus, hemaglutinina en virus da gripe)10,11,12 fusión placentaria (sincitina)13,14,15 e fusións formadoras de gametos en eucariotas inferiores ( HAP2/GCS1 en plantas, protistas e artrópodos) 16,17,18,19.Os fusóxenos dos gametos humanos aínda non se descubriron, aínda que se demostrou que varias proteínas son fundamentais para a unión e a fusión dos gametos.O CD9 expresado polos ovocitos, unha proteína transmembrana necesaria para a fusión de gametos de rato e humanos, foi o primeiro en descubrirse 21,22,23.Aínda que a súa función precisa aínda non está clara, parece probable un papel na adhesión, a estrutura dos focos de adhesión nos microvilli do ovo e/ou a localización correcta das proteínas da superficie do ovocito 24,25,26.As dúas proteínas máis típicas que son críticas para a fusión de gametos son a proteína do esperma IZUMO127 e a proteína do ovocito JUNO28, e a súa asociación mutua é un paso importante no recoñecemento e adhesión de gametos antes da fusión.Os ratos knockout Izumo1 machos e as femias Juno son completamente estériles, nestes modelos os espermatozoides entran no espazo perivitelino pero os gametos non se fusionan.Do mesmo xeito, a confluencia reduciuse cando os gametos foron tratados con anticorpos anti-IZUMO1 ou JUNO27,29 en experimentos de fecundación in vitro en humanos.
Recentemente, descubriuse un grupo recén descuberto de proteínas expresadas por espermatozoides fenotípicamente similares a IZUMO1 e JUNO20,30,31,32,33,34,35.A proteína 6 asociada á membrana acrosomal do esperma (SPACA6) identificouse como esencial para a fertilización nun estudo de mutaxénese murina a gran escala.A inserción do transxene no xene Spaca6 produce espermatozoides non fusibles, aínda que estes espermatozoides infiltran o espazo perivitelino 36 .Estudos de eliminación posteriores en ratos confirmaron que o Spaca6 é necesario para a fusión de gametos 30,32 .SPACA6 exprésase case exclusivamente nos testículos e ten un patrón de localización similar ao de IZUMO1, concretamente dentro da íntima dos espermatozoides antes da reacción acrosomal, e despois migra á rexión ecuatorial despois da reacción acrosomal 30,32.Os homólogos de Spaca6 existen nunha variedade de mamíferos e outros eucariotas 30 e a súa importancia para a fusión de gametos humanos demostrouse pola inhibición da fertilización humana in vitro pola resistencia a SPACA6 30 .A diferenza de IZUMO1 e JUNO, os detalles da estrutura, interaccións e función de PACA6 seguen sen estar claros.
Para comprender mellor o proceso fundamental que subxace á fusión de espermatozoides e óvulos humanos, que nos permitirá informar sobre os desenvolvementos futuros na planificación familiar e o tratamento da fertilidade, realizamos estudos estruturais e bioquímicos PACA6.A estrutura cristalina do dominio extracelular de SPACA6 mostra un feixe de catro hélices (4HB) e un dominio semellante á inmunoglobulina (similar a Ig) conectados por rexións cuasi-flexibles.Como se predixo en estudos anteriores7,32,37, a estrutura do dominio de SPACA6 é similar á do IZUMO1 humano, e as dúas proteínas comparten un motivo inusual: 4HB cunha superficie helicoidal triangular e un par de motivos CXXC ligados a disulfuro.Propoñemos que IZUMO1 e SPACA6 definen agora unha superfamilia de proteínas máis grande e estruturalmente relacionada coa fusión de gametos.Usando características exclusivas da superfamilia, realizamos unha busca exhaustiva do proteoma humano estrutural AlphaFold, identificando membros adicionais desta superfamilia, incluíndo varios membros implicados na fusión e/ou na fecundación de gametos.Agora parece que hai un pregamento estrutural común e unha superfamilia de proteínas asociadas á fusión de gametos, e a nosa estrutura proporciona un mapa molecular deste importante aspecto do mecanismo de fusión de gametos humanos.
SPACA6 é unha proteína transmembrana de paso único cun glicano ligado a N e seis enlaces disulfuro putativos (figuras S1a e S2).Expresamos o dominio extracelular de SPACA6 humano (residuos 27-246) en células Drosophila S2 e purificamos a proteína mediante a afinidade do níquel, o intercambio catiónico e a cromatografía de exclusión de tamaño (Fig. S1b).O ectodominio SPACA6 purificado é moi estable e homoxéneo.A análise mediante cromatografía de exclusión de tamaño combinada con dispersión de luz poligonal (SEC-MALS) revelou un pico cun peso molecular calculado de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Isto é consistente co tamaño do ectodominio monomérico SPACA6, o que indica que a oligomerización non se produciu durante a purificación.Ademais, a espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou unha estrutura α/β mixta cun punto de fusión de 51,3 °C (Fig. S1d, e).A deconvolución dos espectros CD revelou un 38,6% de elementos en helicoidal α e un 15,8% de elementos de cadea β (Figura S1d).
O ectodominio SPACA6 cristalizouse mediante a sementeira de matriz aleatoria38 obtendo un conxunto de datos cunha resolución de 2,2 Å (táboa 1 e figura S3).Usando unha combinación de substitución molecular baseada en fragmentos e datos de fase SAD con exposición ao bromuro para a determinación da estrutura (Táboa 1 e Figura S4), o modelo final refinado consta dos residuos 27-246.No momento en que se determinou a estrutura, non había estruturas experimentais nin AlphaFold dispoñibles.O ectodominio SPACA6 mide 20 Å × 20 Å × 85 Å, consta de sete hélices e nove cadeas β e ten un pregamento terciario alongado estabilizado por seis enlaces disulfuro (Fig. 1a, b).A débil densidade electrónica ao final da cadea lateral de Asn243 indica que este residuo é unha glicosilación ligada a N.A estrutura consta de dous dominios: un feixe de catro hélices N-terminal (4HB) e un dominio tipo Ig C-terminal cunha rexión bisagra intermedia entre eles (Fig. 1c).
a Estrutura do dominio extracelular de SPACA6.Diagrama en tiras do dominio extracelular de PACA6, a cor da cadea de N a C-terminal de azul escuro a vermello escuro.As cisteínas implicadas nos enlaces disulfuro destacan en magenta.b Topoloxía do dominio extracelular de PACA6.Use o mesmo esquema de cores que na Figura 1a.c Dominio extracelular SPANA6.Os gráficos de bandas de dominio 4HB, bisagra e tipo Ig son de cor laranxa, verde e azul, respectivamente.As capas non están debuxadas a escala.
O dominio 4HB de SPACA6 inclúe catro hélices principais (hélices 1-4), que están dispostas en forma de hélice helicoidal (Fig. 2a), alternando entre interaccións antiparalelas e paralelas (Fig. 2b).Unha pequena hélice adicional dunha soa volta (hélice 1′) colócase perpendicularmente ao feixe, formando un triángulo coas hélices 1 e 2. Este triángulo está lixeiramente deformado no empaquetamento helicoidal retorcido do empaquetamento relativamente denso das hélices 3 e 4 ( Fig. 2a).
Gráfico de tiras de terminales N 4HB.b Vista superior dun feixe de catro hélices, cada hélice resaltada en azul escuro no extremo N-terminal e vermello escuro no extremo C-terminal.c Diagrama de roda espiral de arriba abaixo para 4HB, mostrando cada residuo como un círculo marcado cun código de aminoácido dunha soa letra;só están numerados os catro aminoácidos da parte superior da roda.Os residuos non polares teñen cor amarela, os residuos polares sen carga teñen cor verde, os residuos cargados positivamente son de cor azul e os residuos con carga negativa teñen cor vermella.d Caras triangulares do dominio 4HB, con 4HBs en laranxa e bisagras en verde.Ambos insertos mostran enlaces disulfuro en forma de varilla.
4HB concéntrase nun núcleo hidrófobo interno composto principalmente por residuos alifáticos e aromáticos (Fig. 2c).O núcleo contén un enlace disulfuro entre Cys41 e Cys55 que une as hélices 1 e 2 entre si nun triángulo elevado superior (Fig. 2d).Dous enlaces disulfuro adicionais formáronse entre o motivo CXXC en Helix 1′ e outro motivo CXXC atopado na punta da horquilla β na rexión bisagra (Fig. 2d).Un residuo de arginina conservador cunha función descoñecida (Arg37) está situado dentro dun triángulo oco formado polas hélices 1′, 1 e 2. Os átomos de carbono alifáticos Cβ, Cγ e Cδ Arg37 interactúan co núcleo hidrófobo e os seus grupos guanidina móvense cíclicamente. entre as hélices 1′ e 1 mediante interaccións entre a columna vertebral Thr32 e a cadea lateral (Fig. S5a, b).Tyr34 esténdese na cavidade deixando dúas pequenas cavidades polas que Arg37 pode interactuar co disolvente.
Os dominios tipo sándwich β tipo Ig son unha gran superfamilia de proteínas que comparten a característica común de dúas ou máis follas β anfipáticas multicatenarias que interactúan a través dun núcleo hidrofóbico 39. O dominio tipo Ig C-terminal de SPACA6 ten o mesmo patrón. e consta de dúas capas (Fig. S6a).A folla 1 é unha folla β de catro cadeas (caídas D, F, H e I) onde as febras F, H e I forman unha disposición antiparalela e as febras I e D realizan unha interacción paralela.A táboa 2 é unha pequena folla beta de dobre cadea antiparalelo (caídas E e G).Observouse un enlace disulfuro interno entre o extremo C-terminal da cadea E e o centro da cadea H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Este enlace disulfuro é análogo ao enlace disulfuro no dominio sándwich β da inmunoglobulina40,41.
A folla β de catro febras retorce ao longo de toda a súa lonxitude, formando bordos asimétricos que difiren en forma e electrostática.O bordo máis fino é unha superficie ambiental hidrofóbica plana que destaca en comparación coas superficies irregulares e electrostáticamente diversas restantes en PACA6 (Fig. S6b, c).Un halo de grupos carbonilo/amino da columna vertebral exposta e cadeas laterais polares rodea a superficie hidrófoba (Fig. S6c).A marxe máis ampla está cuberta por un segmento helicoidal tapado que bloquea a parte N-terminal do núcleo hidrófobo e forma tres enlaces de hidróxeno co grupo polar aberto da columna vertebral da cadea F (Fig. S6d).A parte C-terminal deste bordo forma un gran peto cun núcleo hidrofóbico parcialmente exposto.O peto está rodeado de cargas positivas debido a tres conxuntos de residuos de arginina dobre (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 e Arg212-Arg214) e unha histidina central (His220) (Figura S6e).
A rexión bisagra é un segmento curto entre o dominio helicoidal e o dominio tipo Ig, que consiste nunha capa β de tres cadeas antiparalelas (caídas A, B e C), unha pequena hélice 310 e varios segmentos helicoidais aleatorios longos.(Fig. S7).Unha rede de contactos covalentes e electrostáticos na rexión bisagra parece estabilizar a orientación entre 4HB e o dominio tipo Ig.A rede pódese dividir en tres partes.A primeira parte inclúe dous motivos CXXC (27CXXC30 e 139CXXC142) que forman un par de enlaces disulfuro entre a horquilla β da bisagra e a hélice 1′ en 4HB.A segunda parte inclúe interaccións electrostáticas entre o dominio tipo Ig e a bisagra.Glu132 na bisagra forma unha ponte salina con Arg233 no dominio tipo Ig e Arg135 na bisagra.A terceira parte inclúe un enlace covalente entre o dominio tipo Ig e a rexión bisagra.Dous enlaces disulfuro (Cys124-Cys147 e Cys128-Cys153) conectan o bucle bisagra cun enlace que se estabiliza mediante interaccións electrostáticas entre Gln131 e o grupo funcional da columna vertebral, permitindo o acceso ao primeiro dominio tipo Ig.cadea.
Utilizáronse a estrutura do ectodominio PACA6 e as estruturas individuais dos dominios 4HB e Ig-like para buscar rexistros estruturalmente similares nas bases de datos de proteínas 42 .Identificamos coincidencias con puntuacións altas de Dali Z, pequenas desviacións estándar e grandes puntuacións LALI (sendo este último o número de residuos estruturalmente equivalentes).Aínda que os primeiros 10 acertos da busca completa de ectodominios (táboa S1) tiñan unha puntuación Z aceptable de > 842, unha busca só por dominio 4HB ou tipo Ig mostrou que a maioría destes acertos correspondían só a bocadillos β.un pregamento ubicuo que se atopa en moitas proteínas.As tres buscas en Dalí deron só un resultado: IZUMO1.
Hai tempo que se suxeriu que PACA6 e IZUMO1 comparten semellanzas estruturais7,32,37.Aínda que os ectodominios destas dúas proteínas asociadas á fusión de gametos comparten só un 21% de identidade de secuencia (Figura S8a), a evidencia complexa, incluíndo un patrón de enlace disulfuro conservado e un dominio tipo Ig C-terminal previsto en SPACA6, permitiron os primeiros intentos de construír un modelo de homoloxía de A un rato SPACA6 usando IZUMO1 como modelo37.A nosa estrutura confirma estas predicións e mostra o verdadeiro grao de semellanza.De feito, as estruturas SPACA6 e IZUMO137,43,44 comparten a mesma arquitectura de dous dominios (Fig. S8b) con dominios similares 4HB e Ig-like β-sandwich conectados por unha rexión bisagra (Fig. S8c).
IZUMO1 e PACA6 4HB teñen diferenzas comúns cos feixes espirais convencionais.Os 4HB típicos, como os que se atopan nos complexos proteicos SNARE implicados na fusión endosómica 45,46, teñen hélices uniformemente espaciadas que manteñen unha curvatura constante ao redor dun eixe central 47. En cambio, os dominios helicoidais tanto en IZUMO1 como en SPACA6 estaban distorsionados, con curvatura variable e embalaxe desigual (Figura S8d).A torsión, probablemente provocada polo triángulo formado polas hélices 1′, 1 e 2, queda retida en IZUMO1 e SPACA6 e estabilizada polo mesmo motivo CXXC na hélice 1′.Non obstante, o enlace disulfuro adicional que se atopa no SPACA6 (Cys41 e Cys55 que unen covalentemente as hélices 1 e 2 anteriores) crea un ápice máis nítido no ápice do triángulo, facendo que SPACA6 sexa máis retorcido que IZUMO1, con triángulos cavitarios máis pronunciados.Ademais, a IZUMO1 carece de Arg37 observada no centro desta cavidade en SPACA6.Pola contra, IZUMO1 ten un núcleo hidrofóbico máis típico de residuos alifáticos e aromáticos.
IZUMO1 ten un dominio tipo Ig que consiste nunha folla β de dobre cadea e de cinco cadeas43.A cadea extra en IZUMO1 substitúe a bobina en SPACA6, que interactúa coa febra F para limitar os enlaces de hidróxeno da columna vertebral na cadea.Un punto de comparación interesante é a carga superficial prevista dos dominios tipo Ig das dúas proteínas.A superficie IZUMO1 está máis cargada negativamente que a superficie PACA6.Unha carga adicional está situada preto do extremo C-terminal que mira á membrana do esperma.En PACA6, as mesmas rexións eran máis neutras ou cargadas positivamente (Fig. S8e).Por exemplo, a superficie hidrófoba (bordes máis delgados) e as fosas cargadas positivamente (bordes máis anchos) en SPACA6 están cargadas negativamente en IZUMO1.
Aínda que a relación e os elementos de estrutura secundaria entre IZUMO1 e SPACA6 están ben conservados, o aliñamento estrutural dos dominios tipo Ig mostrou que os dous dominios difiren na súa orientación xeral entre si (Fig. S9).O feixe espiral de IZUMO1 está curvado arredor do sándwich β, creando a forma de "boomerang" descrita anteriormente a uns 50° do eixe central.Pola contra, o feixe helicoidal no SPACA6 estaba inclinado uns 10° na dirección oposta.As diferenzas nestas orientacións débense probablemente a diferenzas na rexión bisagra.A nivel de secuencia primaria, IZUMO1 e SPACA6 comparten pouca semellanza de secuencia na bisagra, coa excepción dos residuos de cisteína, glicina e ácido aspártico.Como resultado, os enlaces de hidróxeno e as redes electrostáticas son completamente diferentes.Os elementos de estrutura secundaria da folla β son compartidos por IZUMO1 e SPACA6, aínda que as cadeas en IZUMO1 son moito máis longas e a hélice 310 (hélice 5) é exclusiva de SPACA6.Estas diferenzas dan lugar a diferentes orientacións de dominio para dúas proteínas similares.
A nosa busca do servidor Dali revelou que SPACA6 e IZUMO1 son as dúas únicas estruturas determinadas experimentalmente almacenadas na base de datos de proteínas que teñen este pregamento particular de 4HB (táboa S1).Máis recentemente, DeepMind (Alphabet/Google) desenvolveu AlphaFold, un sistema baseado en redes neuronais que pode predecir con precisión as estruturas 3D das proteínas a partir de secuencias primarias48.Pouco despois de resolver a estrutura PACA6, lanzouse a base de datos AlphaFold, que ofrece modelos de estrutura preditiva que cobren o 98,5% de todas as proteínas do proteoma humano48,49.Usando a nosa estrutura SPACA6 resolta como modelo de busca, unha busca de homoloxía estrutural para o modelo no proteoma humano AlphaFold identificou candidatos con posibles semellanzas estruturais con SPACA6 e IZUMO1.Dada a incrible precisión de AlphaFold na predicción de SPACA6 (Fig. S10a) -especialmente o ectodominio de 1,1 Å rms en comparación coa nosa estrutura resolta (Fig. S10b)-, podemos estar seguros de que as coincidencias SPACA6 identificadas probablemente sexan precisas.
Anteriormente, PSI-BLAST buscou o clúster IZUMO1 con outras tres proteínas asociadas aos espermatozoides: IZUMO2, IZUMO3 e IZUMO450.AlphaFold predixo que estas proteínas da familia IZUMO se pregan no dominio 4HB co mesmo patrón de enlaces disulfuro que IZUMO1 (Figuras 3a e S11), aínda que carecen dun dominio similar a Ig.A hipótese de que IZUMO2 e IZUMO3 son proteínas de membrana unilateral similares a IZUMO1, mentres que IZUMO4 parece ser secretada.Non se determinaron as funcións das proteínas IZUMO 2, 3 e 4 na fusión de gametos.Sábese que IZUMO3 xoga un papel na bioxénese dos acrosomas durante o desenvolvemento dos espermatozoides51, e a proteína IZUMO forma un complexo50.A conservación das proteínas IZUMO en mamíferos, réptiles e anfibios suxire que a súa función potencial é consistente coa doutras proteínas asociadas á fusión de gametos coñecidas, como DCST1/2, SOF1 e FIMP.
Diagrama da arquitectura de dominios da superfamilia IST, con dominios 4HB, bisagra e tipo Ig resaltados en laranxa, verde e azul, respectivamente.IZUMO4 ten unha rexión C-terminal única que parece negra.Os enlaces disulfuro confirmados e putativos móstranse mediante liñas sólidas e de puntos, respectivamente.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) e AlphaFold 95 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) móstranse na mesma gama de cores que o panel A. Os enlaces disulfuro móstranse en magenta.Non se mostran as hélices transmembrana TMEM95, IZUMO2 e IZUMO3.
A diferenza da proteína IZUMO, crese que outras proteínas SPACA (é dicir, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 e SPACA9) son estruturalmente diferentes da SPACA6 (Fig. S12).Só SPACA9 ten 4HB, pero non se espera que teña a mesma orientación paralelo-antiparalelo nin o mesmo enlace disulfuro que SPACA6.Só SPACA1 ten un dominio similar a Ig.AlphaFold prevé que SPACA3, SPACA4 e SPACA5 teñen unha estrutura completamente diferente á de SPACA6.Curiosamente, tamén se sabe que SPACA4 xoga un papel na fertilización, pero en maior medida que SPACA6, facilitando en cambio a interacción entre o esperma e a zona pelúcida do ovocito52.
A nosa busca AlphaFold atopou outra coincidencia para IZUMO1 e PACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, unha soa proteína transmembrana específica do espermatozoide, fai que os ratos machos sexan infértiles cando se ablaten 32,33.Os espermatozoides que carecían de TMEM95 tiñan unha morfoloxía, motilidade e capacidade de penetrar na zona pelúcida e unirse á membrana do ovo, pero non podían fusionarse coa membrana do ovocito.Estudos anteriores demostraron que TMEM95 comparte semellanzas estruturais con IZUMO133.De feito, o modelo AlphaFold confirmou que TMEM95 é un 4HB co mesmo par de motivos CXXC que IZUMO1 e SPACA6 e o ​​mesmo enlace disulfuro adicional entre as hélices 1 e 2 que se atopa en SPACA6 (Fig. 3a e S11).Aínda que TMEM95 carece dun dominio similar a Ig, ten unha rexión cun patrón de enlace disulfuro similar ás rexións bisagra SPACA6 e IZUMO1 (Fig. 3b).No momento da publicación deste manuscrito, o servidor de preimpresión informou da estrutura de TMEM95, confirmando o resultado AlphaFold53.TMEM95 é moi semellante ao SPACA6 e IZUMO1 e consérvase evolutivamente xa en anfibios (Fig. 4 e S13).
A busca PSI-BLAST utilizou as bases de datos NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP e SOF1 para determinar a posición destas secuencias na árbore da vida.As distancias entre os puntos de ramificación non se mostran a escala.
A sorprendente semellanza estrutural global entre SPACA6 e IZUMO1 suxire que son membros fundadores dunha superfamilia estrutural conservada que inclúe as proteínas TMEM95 e IZUMO 2, 3 e 4.membros coñecidos: IZUMO1, SPACA6 e TMEM95.Dado que só uns poucos membros posúen dominios de tipo Ig, o selo distintivo da superfamilia IST é o dominio 4HB, que ten características únicas comúns a todas estas proteínas: 1) 4HB enrolado con hélices dispostas nunha alternancia antiparalelo/paralelo (Fig. . 5a), 2) o feixe ten unha cara triangular formada por dúas hélices dentro do feixe e unha terceira hélice vertical (área clave da Fig. (Fig. 5c). Sábese que funciona o motivo CXXC, que se atopa nas proteínas semellantes ás tiorredoxinas). como sensor redox 54,55,56 , mentres que o motivo dos membros da familia IST pode asociarse con proteínas disulfuro isomerasas como ERp57 na fusión de gametos.Os roles están asociados 57,58.
Os membros da superfamilia IST defínense por tres trazos característicos do dominio 4HB: catro hélices que se alternan entre orientación paralela e antiparalela, caras de feixe helicoidal ba-triangular e un dobre motivo ca CXXC formado entre moléculas pequenas.) Hélices N-terminais (laranxa) e rexión bisagra β-horquilla (verde).
Dada a semellanza entre SPACA6 e IZUMO1, probouse a capacidade do primeiro para unirse a IZUMO1 ou JUNO.A interferometría de biocapas (BLI) é un método de unión baseado na cinética que se utilizou anteriormente para cuantificar a interacción entre IZUMO1 e JUNO.Despois da incubación do sensor marcado con biotina con IZUMO1 como cebo cunha alta concentración de analito JUNO, detectouse un sinal forte (Fig. S14a), que indica un cambio inducido pola unión no grosor do biomaterial unido á punta do sensor.Sinais semellantes (é dicir, JUNO acoplado ao sensor como cebo contra o analito IZUMO1) (Fig. S14b).Non se detectou ningún sinal cando se utilizou SPACA6 como analito contra IZUMO1 unido ao sensor ou JUNO unido ao sensor (Figura S14a, b).A ausencia deste sinal indica que o dominio extracelular de SPACA6 non interactúa co dominio extracelular de IZUMO1 ou JUNO.
Dado que o ensaio BLI está baseado na biotinilación de residuos de lisina libre na proteína do cebo, esta modificación pode impedir a unión se os residuos de lisina están implicados na interacción.Ademais, a orientación da unión en relación ao sensor pode crear obstáculos estéricos, polo que tamén se realizaron ensaios pull-down convencionais nos ectodominios SPACA6, IZUMO1 e JUNO recombinantes.A pesar diso, SPACA6 non precipitou con His-tagged IZUMO1 ou His-tagged JUNO (Fig. S14c, d), indicando ningunha interacción consistente coa observada nos experimentos BLI.Como control positivo, confirmamos a interacción de JUNO con His IZUMO1 marcado (Figuras S14e e S15).
A pesar da semellanza estrutural entre SPACA6 e IZUMO1, a incapacidade de SPACA6 para unirse a JUNO non é sorprendente.A superficie do IZUMO1 humano ten máis de 20 residuos que interactúan con JUNO, incluíndo residuos de cada unha das tres rexións (aínda que a maioría deles están situados na rexión bisagra) (Fig. S14f).Destes residuos, só un se conserva en SPACA6 (Glu70).Aínda que moitas substitucións de residuos conservaron as súas propiedades bioquímicas orixinais, o residuo esencial de Arg160 en IZUMO1 foi substituído polo Asp148 cargado negativamente en SPACA6;estudos anteriores demostraron que a mutación Arg160Glu en IZUMO1 elimina case por completo a unión a JUNO43.Ademais, a diferenza na orientación do dominio entre IZUMO1 e SPACA6 aumentou significativamente a superficie do sitio de unión a JUNO da rexión equivalente en SPACA6 (Fig. S14g).
A pesar da necesidade coñecida de SPACA6 para a fusión de gametos e a súa semellanza con IZUMO1, SPACA6 non parece ter unha función de unión a JUNO equivalente.Polo tanto, buscamos combinar os nosos datos estruturais con probas de importancia que proporciona a bioloxía evolutiva.O aliñamento de secuencias dos homólogos de PACA6 mostra a conservación da estrutura común máis aló dos mamíferos.Por exemplo, os residuos de cisteína están presentes mesmo en anfibios distantes (Fig. 6a).Usando o servidor ConSurf, os datos de retención de aliñamento de secuencias múltiples de 66 secuencias foron mapeados na superficie de SPACA6.Este tipo de análise pode mostrar que residuos se conservaron durante a evolución das proteínas e pode indicar que rexións da superficie xogan un papel na función.
a Aliñación de secuencias de ectodominios PACA6 de 12 especies diferentes preparadas usando CLUSTAL OMEGA.Segundo a análise de ConSurf, as posicións máis conservadoras están marcadas en azul.Os residuos de cisteína están resaltados en vermello.Os límites do dominio e os elementos da estrutura secundaria móstranse na parte superior da aliñación, onde as frechas indican cadeas β e as ondas indican hélices.Os identificadores de acceso NCBI que conteñen as secuencias son: humano (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), mono capuchino (Cebus mimic, XP_017359366), cabalo (Equus caballus, XP_02350, XP_0102350) XP_032_034).), ovella (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), perro (Canis lupus familyis, XP_025277208), rato (Mus musculus, NP_001156381), diaño de Tasmania (Sarpi1, XP_03, XP_03) 8) , 61_89 e Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).A numeración baséase na orde humana.b Representación superficial da estrutura PACA6 con 4HB na parte superior e dominio tipo Ig na parte inferior, cores baseadas en estimacións de conservación do servidor ConSurf.As partes mellor conservadas son de cor azul, as partes medianamente conservadas son de branco e as menos conservadas son de amarelo.cisteína violeta.Tres parches de superficie que demostran un alto nivel de protección móstranse no recuadro etiquetado con parches 1, 2 e 3. No recuadro superior dereita móstrase un debuxo animado 4HB (mesmo esquema de cores).
A estrutura PACA6 ten tres rexións superficiais moi conservadas (Fig. 6b).O parche 1 abarca 4HB e a rexión bisagra e contén dúas pontes disulfuro CXXC conservadas, unha rede de bisagras Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) e tres residuos aromáticos externos conservados (Phe31, Tyr73, Phe137).un bordo máis amplo do dominio tipo Ig (Fig. S6e), que representa varios residuos cargados positivamente na superficie do esperma.Curiosamente, este parche contén un epítopo de anticorpos que se demostrou previamente que interfire coa función PACA6 30.A rexión 3 abrangue a bisagra e un lado do dominio tipo Ig;esta rexión contén prolinas conservadas (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) e residuos polares/cargados orientados cara ao exterior.Sorprendentemente, a maioría dos residuos na superficie de 4HB son moi variables (Fig. 6b), aínda que o pregamento consérvase en todo o homólogo de SPACA6 (como indica o conservadurismo do núcleo do feixe hidrófobo) e máis aló da superfamilia IST.
Aínda que esta é a rexión máis pequena de SPACA6 con menos elementos de estrutura secundaria detectables, moitos restos da rexión bisagra (incluída a rexión 3) están moi conservados entre os homólogos de SPACA6, o que pode indicar que a orientación do feixe helicoidal e do sándwich β xoga un papel importante.como conservador.Non obstante, a pesar das extensas conexións de hidróxeno e redes electrostáticas na rexión bisagra de SPACA6 e IZUMO1, pódense ver evidencias de flexibilidade intrínseca no aliñamento das múltiples estruturas permitidas de IZUMO137,43,44.O aliñamento dos dominios individuais superpuxose ben, pero a orientación dos dominios entre si variou de 50 ° a 70 ° desde o eixe central (Fig. S16).Para comprender a dinámica conformacional de PACA6 en solución, realizáronse experimentos SAXS (Fig. S17a, b).A reconstrución ab initio do ectodominio SPACA6 conforme a unha estrutura de cristal de vara (Fig. S18), aínda que o diagrama de Kratky mostrou certo grao de flexibilidade (Fig. S17b).Esta conformación contrasta coa IZUMO1, na que a proteína non unida adquire forma de boomerang tanto na rede como na disolución43.
Para identificar especificamente a rexión flexible, realizouse a espectroscopia de masas de intercambio hidróxeno-deuterio (H-DXMS) en SPACA6 e comparouse cos datos obtidos anteriormente en IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 é claramente máis flexible que IZUMO1, como indica un maior intercambio de deuterio en toda a estrutura despois de 100.000 s de intercambio.En ambas as estruturas, a parte C-terminal da rexión bisagra mostra un alto nivel de intercambio, o que probablemente permite unha rotación limitada de dominios 4HB e Ig-like entre si.Curiosamente, a parte C-terminal da bisagra SPACA6, que consiste no residuo 147CDLPLDCP154, é unha rexión 3 altamente conservada (Fig. 6b), o que posiblemente indica que a flexibilidade entre dominios é unha característica conservada evolutivamente de SPACA6.Segundo a análise de flexibilidade, os datos de fusión térmica de CD mostraron que SPACA6 (Tm = 51,2 °C) é menos estable que IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e e S19).
a imaxes H-DXMS de SPACA6 e b IZUMO1.A porcentaxe de intercambio de deuterio determinouse nos puntos de tempo indicados.Os niveis de intercambio hidróxeno-deuterio indícanse por cor nunha escala de gradiente de azul (10%) a vermello (90%).As caixas negras representan áreas de alto intercambio.Os límites do dominio 4HB, bisagra e tipo Ig observados na estrutura cristalina móstranse enriba da secuencia primaria.Os niveis de intercambio de deuterio aos 10 s, 1000 s e 100.000 s representáronse nun gráfico de tiras superposto ás superficies moleculares transparentes de SPACA6 e IZUMO1.As partes das estruturas cun nivel de intercambio de deuterio por debaixo do 50% teñen cor branca.As áreas por riba do 50% de intercambio H-DXMS están coloreadas nunha escala de gradiente.
O uso de CRISPR/Cas9 e estratexias xenéticas de eliminación de xenes de rato levou á identificación de varios factores importantes para a unión e fusión de espermatozoides e óvulos.Ademais da ben caracterizada interacción da estrutura IZUMO1-JUNO e CD9, a maioría das proteínas asociadas á fusión de gametos seguen sendo estrutural e funcionalmente enigmáticas.A caracterización biofísica e estrutural de SPACA6 é outra peza do puzzle molecular de adhesión/fusión durante a fertilización.
SPACA6 e outros membros da superfamilia IST parecen estar moi conservados en mamíferos, así como en aves individuais, réptiles e anfibios;de feito, pénsase que incluso se require SPACA6 para a fecundación no peixe cebra 59. Esta distribución é similar a outras proteínas coñecidas asociadas á fusión de gametos como DCST134, DCST234, FIMP31 e SOF132, o que suxire que estes factores son deficientes en HAP2 (tamén coñecidas como GCS1) proteínas que son responsables da actividade catalítica de moitos protistas., plantas e artrópodos.Proteínas de fusión fertilizadas 60, 61. A pesar da forte semellanza estrutural entre SPACA6 e IZUMO1, a eliminación de xenes que codifican calquera destas proteínas provocou infertilidade en ratos machos, o que indica que as súas funcións na fusión de gametos non están duplicadas..De forma máis ampla, ningunha das proteínas de esperma coñecidas necesarias para a fase de adhesión da fusión é redundante.
Queda unha cuestión aberta se SPACA6 (e outros membros da superfamilia IST) participan en unións intergaméticas, forman redes intragaméticas para recrutar proteínas importantes nos puntos de fusión, ou quizais mesmo actúan como fusóxenos esquivos.Estudos de co-inmunoprecipitación en células HEK293T revelaron unha interacción entre IZUMO1 e SPACA632 de lonxitude total.Non obstante, os nosos ectodominios recombinantes non interactuaron in vitro, o que suxire que as interaccións observadas en Noda et al.ambos foron eliminados na construción (nótese na cola citoplasmática de IZUMO1, que se demostrou que non é necesaria para a fecundación62).Alternativamente, IZUMO1 e/ou SPACA6 poden requirir ambientes de unión específicos que non reproducimos in vitro, como conformacións fisioloxicamente específicas ou complexos moleculares que conteñan outras proteínas (coñecidas ou aínda non descubertas).Aínda que se cre que o ectodominio IZUMO1 media a unión dos espermatozoides ao óvulo no espazo perivitelino, a finalidade do ectodominio SPACA6 non está clara.
A estrutura de PACA6 revela varias superficies conservadas que poden estar implicadas nas interaccións proteína-proteína.A parte conservada da rexión bisagra inmediatamente adxacente ao motivo CXXC (denominado Parche 1 arriba) ten varios residuos aromáticos orientados cara ao exterior que adoitan estar asociados con interaccións hidrófobas e de apilado π entre biomoléculas.Os lados amplos do dominio tipo Ig (rexión 2) forman un suco cargado positivamente con residuos Arg e His altamente conservados, e anteriormente utilizáronse anticorpos contra esta rexión para bloquear a fusión de gametos 30 .O anticorpo recoñece o epítopo lineal 212RIRPAQLTHRGTFS225, que ten tres dos seis residuos de arginina e His220 altamente conservado.Non está claro se a disfunción se debe ao bloqueo destes residuos específicos ou a toda a rexión.A localización desta brecha preto do extremo C-terminal do bocadillo β indica interaccións cis con proteínas espermáticas veciñas, pero non coas proteínas do ovocito.Ademais, a retención dunha maraña altamente flexible rica en prolina (sitio 3) dentro da bisagra pode ser o lugar dunha interacción proteína-proteína ou, máis probablemente, indicar a retención de flexibilidade entre os dous dominios.O xénero é importante para o papel descoñecido de PACA6.fusión de gametos.
O SPACA6 ten propiedades de proteínas de adhesión intercelular, incluíndo os bocadillos β similares a Ig.Moitas proteínas adhesivas (por exemplo, cadherinas, integrinas, adhesinas e IZUMO1) posúen un ou máis dominios sándwich β que estenden as proteínas desde a membrana celular ata os seus obxectivos ambientais63,64,65.O dominio tipo Ig de SPACA6 tamén contén un motivo que se atopa habitualmente nos bocadillos β de adhesión e cohesión: dobres de fíos paralelos nos extremos dos bocadillos β, coñecidos como abrazaderas mecánicas66.Crese que este motivo aumenta a resistencia ás forzas de cizallamento, o que é valioso para as proteínas implicadas nas interaccións intercelulares.Non obstante, a pesar desta semellanza coas adhesinas, actualmente non hai probas de que PACA6 interactúe coas claras de ovo.O ectodominio SPACA6 non pode unirse a JUNO, e as células HEK293T que expresan SPACA6, como se mostra aquí, apenas interactúan cos ovocitos que carecen da zona 32.Se o PACA6 establece enlaces intergaméticos, estas interaccións poden requirir modificacións postraducionais ou estabilización por outras proteínas do esperma.Para apoiar esta última hipótese, os espermatozoides deficientes en IZUMO1 únense aos ovocitos, demostrando que outras moléculas distintas de IZUMO1 están implicadas na etapa de adhesión dos gametos 27 .
Moitas proteínas de fusión virais, celulares e de desenvolvemento teñen propiedades que predicen a súa función como fusóxenos.Por exemplo, as glicoproteínas de fusión virais (clases I, II e III) teñen un péptido ou bucle de fusión hidrófobo ao final da proteína que se insire na membrana do hóspede.O mapa de hidrofilia de IZUMO143 e a estrutura (determinada e prevista) da superfamilia IST non mostraron un aparente péptido de fusión hidrofóbica.Así, se algunha proteína da superfamilia IST funciona como fusóxenos, faino dun xeito diferente ao doutros exemplos coñecidos.
En conclusión, as funcións dos membros da superfamilia IST de proteínas asociadas á fusión de gametos seguen sendo un misterio tentador.A nosa molécula recombinante SPACA6 caracterizada e a súa estrutura resolta proporcionarán información sobre as relacións entre estas estruturas compartidas e o seu papel na unión e fusión de gametos.
A secuencia de ADN correspondente ao ectodominio SPACA6 humano previsto (número de acceso NCBI NP_001303901.1; residuos 27-246) optimizouse con codóns para a expresión en células de Drosophila melanogaster S2 e sintetizouse como un fragmento de xenes coa secuencia que codifica Kozak (Eurofin)., o sinal de secreción de BiP e os extremos 5′ e 3′ correspondentes para a clonación deste xene independente da ligadura nun vector de expresión pMT baseado nun promotor de metalotioneína modificado para a selección con puromicina (pMT-puro).O vector pMT-puro codifica un sitio de escisión da trombina seguido dunha etiqueta 10x-His C-terminal (Figura S2).
A transfección estable do vector SPACA6 pMT-puro en células D. melanogaster S2 (Gibco) realizouse de xeito similar ao protocolo utilizado para IZUMO1 e JUNO43.As células S2 foron desconxeladas e cultivadas en medio de Schneider (Gibco) complementado cunha concentración final do 10% (v/v) de soro fetal de tenreiro inactivado por calor (Gibco) e 1X antimicótico (Gibco).As células de paso temperán (3,0 x 106 células) colocáronse en pozos individuais de placas de 6 pocillos (Corning).Despois de 24 horas de incubación a 27 °C, as células transfectáronse cunha mestura de 2 mg do vector SPACA6 pMT-puro e reactivo de transfección Effectene (Qiagen) segundo o protocolo do fabricante.As células transfectadas incubáronse durante 72 horas e despois recolléronse con 6 mg/ml de puromicina.A continuación illaronse as células do medio completo de Schneider e colocáronse nun medio Insect-XPRESS (Lonza) libre de soro para a produción de proteínas a gran escala.Cultivouse un lote de 1 L de cultivo de células S2 ata 8-10 × 106 ml-1 células nun matraz Erlenmeyer de polipropileno de fondo plano ventilado de 2 L e despois esterilizause cunha concentración final de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) e filtróuse de forma estéril.inducido.Os cultivos inducidos incubáronse a 27 °C a 120 rpm durante catro días.
Illouse o medio acondicionado que contén SPACA6 mediante centrifugación a 5660 × g a 4 °C seguido dun sistema de filtración de fluxo tanxencial Centramate (Pall Corp) cunha membrana MWCO de 10 kDa.Aplique medio concentrado que contén SPACA6 a unha columna de 2 ml de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen).A resina Ni-NTA foi lavada con 10 volumes de columna (CV) de tampón A e despois engadiuse 1 CV de tampón A para dar unha concentración final de imidazol de 50 mM.SPACA6 eluíuse con 10 ml de tampón A suplementado con imidazol ata unha concentración final de 500 mM.A trombina de clase de restrición (Millipore Sigma) engadiuse directamente ao tubo de diálise (MWCO 12-14 kDa) a 1 unidade por mg de SPACA6 fronte a 1 L 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 e 150 mM de NaCl (tampón B) para a diálise.) a 4 °C durante 48 horas.A continuación, o SPACA6 escindido por trombina foi diluído tres veces para reducir a concentración de sal e cargouse nunha columna de intercambio catiónico MonoS 5/50 GL de 1 ml (Cytiva/GE) equilibrada con Tris-HCl 10 mM, pH 7,5.O intercambiador catiónico lavouse con 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, despois eluíuse SPACA6 cun gradiente lineal de 0 a 500 mm NaCl en 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 durante 25 OK.Despois da cromatografía de intercambio iónico, SPACA6 concentrouse a 1 ml e eluíuse isocráticamente a partir dunha columna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrada co tampón B. Segundo o cromatograma, as fraccións agrupadas e concentradas que conteñen SPACA6.A pureza foi controlada mediante electroforese tinguida con Coomassie nun xel de poliacrilamida SDS ao 16%.A concentración de proteína cuantificouse por absorbancia a 280 nm utilizando a lei de Beer-Lambert e o coeficiente de extinción molar teórico.
SPACA6 purificado foi dializado durante a noite contra fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 e NaF 150 mM e diluído a 0,16 mg/ml antes da análise por espectroscopia CD.A exploración espectral de CDs cunha lonxitude de onda de 185 a 260 nm foi recollida nun espectropolarimetro Jasco J-1500 utilizando cubetas de cuarzo cunha lonxitude de camiño óptico de 1 mm (Helma) a 25 °C a unha velocidade de 50 nm/min.Os espectros CD foron corrixidos na liña de base, promediaron en 10 adquisicións e convertéronse a elipticidade residual media (θMRE) en graos cm2/dmol:
onde MW é o peso molecular de cada mostra en Da;N é o número de aminoácidos;θ é a elipticidade en miligraos;d corresponde á lonxitude do camiño óptico en cm;concentración de proteínas en unidades.