Compoñente químico de tubos enrolados de aceiro inoxidable 310 10*1 mm, os dominios N-terminais da spidroína forman hidroxeles baseados en fibrillas amiloides e proporcionan unha plataforma para a inmobilización de proteínas.

Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Control deslizante que mostra tres artigos por diapositiva.Usa os botóns atrás e seguinte para moverte polas diapositivas ou os botóns do controlador de diapositivas ao final para moverte por cada diapositiva.

Especificación

Provedores de tubos enrolados de aceiro inoxidable 310 10*1 mm

Composición Química

Propiedades mecánicas

As proteínas de seda de araña recombinantes (proteínas de seda de araña) teñen moitas aplicacións potenciais no desenvolvemento de novos biomateriais, pero a súa natureza multimodal e propensa á agregación fai que sexan difíciles de obter e fáciles de usar.Aquí informamos de que as proteínas espidroínas en miniatura recombinantes e, sobre todo, o propio dominio N-terminal (NT) forman rapidamente hidroxeles autosuficientes e transparentes a 37 °C.as proteínas de fusión que consisten en NT e proteína fluorescente verde ou purina nucleósido fosforilase forman proteínas de fusión totalmente funcionais.Hidroxeles.Os nosos resultados mostran que as proteínas recombinantes de NT e de fusión proporcionan altos rendementos de expresión e dotan aos hidroxeles de propiedades atractivas como transparencia, xelación sen reticulación e inmobilización directa de proteínas activas a alta densidade.
As arañas teñen ata sete conxuntos diferentes de glándulas de seda, cada unha das cales produce un tipo específico de seda.As sete especies de seda están compostas por proteínas de seda de araña (spidroins) duns 6000 residuos de lonxitude e conteñen unha gran rexión central de repetición rodeada de dominios esféricos N- e C-terminais (NT e CT)1,2.O tipo de seda máis estudado, a ampolla primaria, é producida pola glándula da ampolla primaria.Nesta glándula, unha monocapa de células epiteliais sintetiza proteínas spidroína e segregas no lume da glándula, onde están presentes en forma soluble (dopaxe) en concentracións extremadamente altas (30-50% p/v)3,4.A organización e conformación das principais proteínas spidroin ampulares na glándula foi debatida, pero a maioría das probas experimentais indican a presenza dunha conformación helicoidal xeralmente helicoidal e/ou aleatoria e estruturas micelares ou lamelares5,6,7,8,9,10.Mentres que os dominios repetitivos regulan as propiedades mecánicas das fibras de seda, formando nanocristais de folla β e estruturas amorfas11,12,13,14,15, os dominios finais regulan as fibras de seda en resposta ás condicións cambiantes ao longo da glándula da seda16,17,18.Ao controlar a formación da seda, 19. Os dominios terminais consérvanse evolutivamente e a súa función pode ser común a todas as proteínas da spidroína 2,20,21.Durante o paso pola glándula, o pH da spidroína diminúe de aproximadamente 7,6 a < 5,716 e aumenta co corte e estiramento mediado polo movemento a través do conduto que se estreita gradualmente.En solución, CT é un dímero paralelo constitutivo α-helicoidal17, pero en resposta a un pH baixo e forzas de cizallamento, a CT desprégase e cambia as capas β16, 17, posiblemente desencadeando capas β nas rexións repetitivas de Convert 16. NT son monómeros baixo condicións que reflicten as condicións na luz da glándula e median a solubilidade da spidroína, pero a pH reducido, a protonación dunha serie de cadeas laterais de ácido carboxílico leva á dimerización de NT cun pKa de aproximadamente 6,5, estabilizando así a NT e fixando a spidroína en grandes cantidades. cantidades.redes16,18.Así, o NT xoga un papel fundamental na formación do filamento, cambiando dun monómero no revestimento a un dímero na fibra23,24,25.O NT segue sendo altamente soluble e helicoidal en todas as condicións estudadas ata a data16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, o que inspirou o seu desenvolvemento como un marcador que mellora a solubilidade para a produción de proteínas heterólogas.
A mini proteína de seda de araña recombinante, que consiste nun NT, unha rexión de repetición curta, un CT e unha etiqueta His6 (His-NT2RepCT) para a purificación, é tan soluble en tampón acuoso como a proteína nativa da seda de araña e imita as características importantes nativas da araña de seda. .cobertura 25.31.O His-NT2RepCT pódese fiar en fibras continuas mediante unha máquina biomimética na que se extruye un revestimento soluble de pH 8 nun baño de auga de pH 525,32,33,34,35.A fermentación do biorreactor de E. coli que expresa His-NT2RepCT e o posterior post-tratamento deu como resultado un rendemento > 14 g/L despois da purificación.O alto rendemento, a alta solubilidade e a resposta adecuada de His-NT2RepCT ás condicións ácidas atribúense a NT23, 25, 34.
Aquí informamos da rápida formación de hidroxeles transparentes a partir de proteínas spidroína recombinantes, incluíndo só NT, incubando unha solución proteica a 37 °C.Usando fluorescencia de tioflavina T (ThT), espectroscopia infravermella de transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) e microscopía electrónica de transmisión (TEM), descubrimos que as proteínas NT e microaraña sofren transformación estrutural en follas β e fibrillas de tipo amiloide. cando se forman xeles.Ademais, as proteínas de fusión de NT e a proteína fluorescente verde (GFP) ou a purina nucleósido fosforilase (PNP) forman hidroxeles con fragmentos de fusión totalmente funcionais.A expresión de alto rendemento en hóspedes heterólogos, unida á rápida formación de hidroxeles en condicións fisiolóxicas, abre a posibilidade dunha produción rendible de hidroxeles con funcións de enxeñería.
A diferenza da maioría das proteínas spidroína recombinantes reportadas36, His-NT2RepCT é estable no tampón Tris-HCl a pH 8 e pódese concentrar ata 500 mg/ml sen precipitación25.Polo tanto, sorprendeunos descubrir que esta proteína forma rapidamente hidroxeles ópticamente claros e autoportantes cando se incuba a 37 ° C (Fig. 1b-d).Estudos posteriores demostraron que a xelación de His-NT2RepCT produciuse nunha ampla gama de concentracións de proteínas (10-300 mg/ml) e que esta concentración estaba inversamente correlacionada co tempo de xelación (figura 1c e figura complementaria 1).Para descubrir que partes de His-NT2RepCT median a formación de hidroxel, examinamos cada dominio individualmente e en varias combinacións mediante un ensaio de inversión de matraz (Figura 1a, b).Todas as fraccións probadas de spidroin recombinante formaron xeles (a unha concentración de proteína de 300 mg/ml) en menos de 1 h, agás o 2Rep precipitado (Fig. 1b).Isto suxire que a NT e a TC sós, en combinación ou asociadas con repeticións, poden xelificarse a 37 °C e que a etiqueta His6 non afecta este proceso de forma significativa.Dada a noción común de que a NT é unha proteína altamente soluble e estable, e que os informes anteriores de hidroxeles de spidroína recombinante atribuíron efectos de xelación a cambios conformacionais en rexións repetidas e/ou CT, o propio NT podería.O descubrimento da xelación foi inesperado.Táboa complementaria 1) 37, 38, 39. Sorprendentemente, a NT xa gelificou en 10 minutos a unha concentración ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Os experimentos de inversión de frascos con varias concentracións de NT mostraron que a > 50 mg/mL a solución de NT gelificouse máis rápido que His-NT2RepCT na concentración correspondente (p/v, Figura 1c).
Representación esquemática de varios construtos de spidroin estudados neste traballo.b Tempo de xel a 37 °C para varias proteínas spidroína recombinantes (300 mg/mL) verificado invertendo o vial.Xel CT inmediatamente sen incubación (<300 mg/mL), precipitados 2Rep (300 mg/mL, escala de 5 mm).c Tempo de xel de His-NT2RepCT e NT nas concentracións proteicas indicadas a 37 °C.d Fotografías de hidroxeles His-NT2RepCT e NT coa araña e a letra "NT" impresas debaixo, respectivamente (ambos 200 mg/mL, barra de escala 5 mm).
Os hidroxeles formados por varias proteínas de spidroína recombinantes teñen cores lixeiramente diferentes, e a observación a simple vista mostra distintos graos de transparencia (Fig. 1b).Os xeles NT son excepcionalmente claros mentres que outros xeles se fan opacos.Os xeles His-NT2RepCT e NT fundidos en tubos cilíndricos poderían retirarse do molde intactos (Fig. 1d).
Para probar se os revestimentos naturais de seda de araña se xelan nas condicións que agora se atopan que provocan a xelación das proteínas de spidroína recombinantes, recolléronse revestimentos da gran glándula ampolla da araña ponte sueca (Larinioides sclopetarius).Os revestimentos almacenáronse en tampón Tris-HCl de 20 mM a 50 mg/mL (con base no peso seco medido), pero non se observou xelación durante a incubación de 21 días a 37 ° C (Figura complementaria 2a).
Para cuantificar estes xeles, pódense utilizar medicións reolóxicas para estudar o proceso de xelación e determinar as propiedades mecánicas xerais.En particular, o seguimento do módulo de almacenamento (elasticidade) a temperaturas elevadas pode proporcionar información sobre a temperatura de xelificación así como as propiedades viscoelásticas do revestimento.Os experimentos de aumento da temperatura (usando 1 °C/min a 25-45 °C, baseados en estudos anteriores utilizando solucións de seda natural)40,41 mostraron que os módulos de almacenamento das solucións His-NT2RepCT e NT aumentaban co aumento da temperatura.aumentou (fig. 2 e figura complementaria 3).Notablemente, o módulo NT comezou a crecer a unha temperatura máis baixa en comparación co His-NT2RepCT, consistente co tempo de xel máis rápido observado cando NT se incubou directamente con His-NT2RepCT a 37 °C (Figura 1).Despois dunha caída posterior da temperatura, o módulo de almacenamento non volveu a valores máis baixos e mantívose por riba do módulo de perda (consulte a figura complementaria 3), o que indica unha xelación estable térmicamente irreversible.Despois da xelificación, o módulo elástico final variou de 15 a 330 kPa para os hidroxeles His-NT2RepCT nunha concentración de 100-500 mg/ml, e o módulo elástico final para os hidroxeles NT (100-500 mg/ml) variou de 2 a 1400. kPa (Fig. 2 e datos completos da rampa) consulte a Fig. 3 complementaria).
a Cambio de temperatura durante as medicións de His-NT2RepCT (300 mg/mL) e b NT (300 mg/mL) con axitación.As frechas indican a tendencia da temperatura e o sombreado máis claro dos datos do módulo de almacenamento representa probas con valores de par inferior para o instrumento que os especificados polo fabricante, que é a causa do aumento do ruído.c Acumulación do módulo final de His-NT2RepCT e NT despois dunha temperatura elevada (100, 300 e 500 mg/mL).Todas as lecturas do módulo realízanse a unha frecuencia de 0,1 Hz.
Como método potencial para investigar os cambios conformacionais asociados á xelación, rexistramos os espectros FTIR de His-NT2RepCT e NT antes e despois da xelación a 37 ° C (Figura 3a, b).Como era de esperar, os espectros das solucións His-NT2RepCT e NT correspondían a proteínas que mostraban estrutura secundaria de hélice α/bobina aleatoria, cunha banda pronunciada a 1645 cm-1.Para ambos os hidroxeles, a xelación deu lugar á formación de dous brazos na banda I media a uns 1617 cm-1 e 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), o que indica a formación de estruturas de follas β antiparalelas.Estes cambios tamén se poden ver claramente nos respectivos espectros de xelación da segunda derivada e da diferenza (figura complementaria 4b).As dúas bandas da capa β de NT foron máis pronunciadas que as de His-NT2RepCT, o que indica que o contido total de bandas da capa β no hidroxel NT era maior que o do hidroxel NT2RepCT.
a espectros de absorción FTIR de His-NT2RepCT e b NT (ambos 500 mg/mL) antes (disolución) e despois (xel) ​​da incubación a 37 °C.c Imaxes TEM de xeles NT2RepCT de 50 mg/ml resuspendidos e d NT.Barra de escala 200 nm.e Diámetros de fibra dos hidroxeles His-NT2RepCT e NT.n = 100 fibrillas medidas, p < 0,0001.As barras de erro mostran a desviación estándar.O centro das barras de erro é a media.Utilizouse unha proba t non pareada (de dúas colas) para a análise estatística.f Fluorescencia ThT de varias proteínas spidroína recombinantes (100 mg/ml) a 37 °C sen axitación.g Experimentos de inoculación de NT (100 mg/ml) a partir de xel de NT de 100 mg/ml con 0%, 5%, 10% e 20% de sementes.
A análise do xel mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostrou que o hidroxel está formado por fibrillas de tipo amiloide (figs. 3c, 3d).As fibrillas formadas por NT eran alongadas (5-12 nm de diámetro) e non ramificadas, mentres que as fibrillas His-NT2RepCT eran de lonxitude máis curta e significativamente máis amplas de diámetro (7-16 nm) (Fig. 3e).Estes resultados permitíronnos seguir a cinética da fibrose mediante o ensaio de tioflavina T (ThT).Para todas as proteínas de spidroína recombinantes, o sinal fluorescente aumentou cando as mostras se incubaron a 37 ° C (figura 3f, figura complementaria 5a).En consonancia con este achado, o exame microscópico de NT e His-NT2RepCT en condicións de gelificación revelou un aumento uniforme da fluorescencia de ThT sen acumulación local notable de agregados ThT positivos (Figura complementaria 5b, c).A formación de fibrillas ThT-positivas non estivo acompañada dun aumento da turbidez de NT e His-NTCT (figura complementaria 5d), o que significa que podería formarse unha rede de fibrillas no xel sen comprometer a claridade do xel.A sementeira engadindo pequenas cantidades de fibrillas preformadas pode acelerar significativamente a formación de fibrillas dalgúns amiloides42,43,44 pero engadindo 5%, 10% ou 20% (p/p) de NT a unha solución de hidrocoagulantes NT.efecto de sementeira (Fig. 3g).Quizais isto débese ao feito de que as fibrillas do hidroxel están relativamente fixas e non se poden usar como sementes.
O comportamento inesperado das proteínas spidroína recombinantes a altas temperaturas provocou máis estudos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para identificar os cambios conformacionais asociados á formación de xel.Os espectros de RMN das solucións His-NT2RepCT rexistradas ao longo do tempo a 37 °C mostraron que a CT aínda estaba parcialmente dobrada, mentres que os sinais NT e 2Rep desapareceran (Fig. 4a), o que suxire que era principalmente NT e 2Rep os que controlaban parcialmente a formación de His- Hidroxel NT2RepCT.O sinal de CT tamén se atenuou ata o 20% da súa intensidade orixinal, o que suxire que a TC tamén está maioritariamente fixada e incorporada á estrutura do hidroxel.Para unha porción máis pequena da TC, que é tan móbil como na mostra preincubada e, polo tanto, observada mediante RMN da solución, os espectros carecen de sinais para os primeiros 10 residuos estruturados, posiblemente debido á difícil inmobilización da parte adxunta de His-NT2Rep.Os espectros de RMN do -estado dos hidroxeles -NT2RepCT revelaron a presenza predominante de hélices α e capas β e, en menor medida, a conformación da bobina aleatoria (Fig. 4b).A análise de desprazamento químico dos residuos de metionina presentes só en NT mostrou que este dominio se converteu nunha estrutura de folla β.Os espectros dependentes do tempo de NT en solución mostraron unha diminución uniforme da intensidade do sinal (Fig. 4c), e a RMN en estado sólido de hidroxeles de NT mostrou que a maioría dos residuos de NT convertéronse en estruturas de folla β (Fig. 4d).A conformación de 2Rep non se puido determinar por separado debido á súa tendencia a agregarse.Non obstante, os espectros de RMN en estado sólido dos hidroxeles NTCT e His-NT2RepCT parecían moi similares (Fig. 4b; Fig. 6b complementaria), o que suxire que 2Rep contribuíu pouco á parte estrutural do hidroxel His-NT2RepCT.Para os hidroxeles CT, atopáronse hélices α, follas β e estruturas secundarias helicoidais aleatorias (figura complementaria 6d).Isto suxire que algunhas partes do CT seguen sendo hélices α mentres que outras convértense en follas β.Así, os resultados da espectroscopia de RMN suxiren que a NT é importante para a formación de hidroxel e que tamén se transforma nunha conformación de folla β tras a fusión con 2Rep e CT.En consonancia con isto, recentemente descubrimos que as cremalleiras espaciais amiloides probablemente se forman nas cinco hélices do dominio NT, e o algoritmo Waltz predixo unha rexión amiloidogénica na hélice 1 (Fig. 4e).
Espectros 2D da solución 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT antes (azul) e 19 horas despois da incubación (vermello) a 37 °C.Os picos cruzados individuais no espectro vermello e F24, G136, poliA no espectro azul denotanse mediante símbolos de aminoácidos dunha soa letra e números de residuos.Os insertos mostran a dependencia da intensidade do sinal no tempo para os residuos seleccionados dos dominios NT, 2Rep e CT.b Espectros de radiofrecuencia en estado sólido (RFDR) de hidroxeles His-NT2RepCT.As correlacións dos residuos de Cα/Cβ observados nos espectros RFDR determináronse mediante a comparación cos desprazamentos químicos do péptido modelo e os valores derivados das estatísticas82,83 e das súas estruturas secundarias.SSB: banda lateral xiratoria.c Espectros unidimensionales da solución 15N-HSQC 10 mg/ml NT durante a incubación a 37 °C durante 36 horas.O recuadro mostra a intensidade volumétrica en función do tempo.d Espectros RFDR en estado sólido de hidroxeles NT.Indícanse as correlacións dos residuos Cα/Cβ e as súas estruturas secundarias observadas nos espectros RFDR.e Baseado no perfil de propensión á fibrilación NT45.79 da base de datos Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).A enerxía de Rosetta da xanela de desprazamento espacial do raio do hexapéptido móstrase en kcal/mol.As barras vermellas indican hexapéptidos cunha alta propensión á fibrose (enerxía Rosetta inferior a -23 kcal/mol; por debaixo da liña de puntos).As barras verdes indican fragmentos con enerxías Rosetta por riba do limiar e, polo tanto, menos propensos a formar cremalleiras estéricas.Os fragmentos que conteñen prolina foron excluídos da análise (sen columnas).Os cadrados indican áreas de amiloidose previstas polo algoritmo Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).A secuencia de residuos de aminoácidos de NT está na parte superior, e os tipos de residuos que se atopan na estrutura secundaria β (determinados por espectroscopia de RMN de estado sólido) móstranse en vermello.As posicións das cinco hélices α NT desíñanse como (H1-H5)28.
A pH <6,5, a HT dimerízase, sendo resistente á desnaturalización inducida por calor ou urea18.Para dilucidar como a dimerización e a estabilidade de NT afectan á xelación, controláronse solucións que conteñan 100 mg/ml de NT a pH 8, 7 e 6 mediante a proba de inversión do frasco.As mostras de NT incubadas a pH 8 e 7 gelificaron despois de 30 min a 37 °C, pero o xel de pH 8 permaneceu claro, mentres que o xel de pH 7 mostrou un precipitado visible (Fig. 5a).Pola contra, unha solución que contiña HT a pH 6 non formou un xel, e un gran precipitado puido verse despois de 20 min a 37 °C.Isto suxire que os propios dímeros e/ou a súa maior estabilidade en comparación cos monómeros evitan a xelación.Non se esperaba a formación dun precipitado para NT a pH 7 e 6, xa que se informou de que NT é soluble a 200 mg/ml27, replícase facilmente despois da desnaturalización térmica e tamén conserva unha hélice α a valores máis baixos de pH 18. Unha explicación probable destas discrepancias é que os experimentos previamente informados foron realizados a temperatura ambiente ou por debaixo, ou en concentracións de proteínas relativamente baixas16,18,19.
Proba de inversión de vial NT (100 mg/ml) a pH 8, 7, 6 e NaCl 154 mM (pH 8) despois da incubación a 37 °C.b Espectros NT CD con e sen NaF 154 mM e NaCl 154 mM, respectivamente.A elipticidade molar a 222 nm convértese nunha proporción de pregamentos naturais.c Ensaio de inversión de NT (100 mg/mL) NT* (37 °C e 60 °C), NTA72R (37 °C) e His-NT-L6 (37 °C e 60 °C).d Espectros CD de NT mutantes NT*, NTA72R e His-NT-L6.A elipticidade molar a 222 nm convértese nunha proporción de pregamentos naturais.e Proba de inversión de NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp reducida (100 mg/mL).Barra de escala 5 mm.f espectros CD de NT, NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp reducido.A elipticidade molar a 222 nm convértese nunha proporción de pregamentos naturais.Os espectros NT completos a 25 °C e 95 °C móstranse na figura complementaria 8.
A concentración fisiolóxica de sal determina as interaccións electrostáticas entre as subunidades de NT e a dimerización da transferencia de NT a pH18 máis baixo.Descubrimos que a presenza de 154 mM de NaCl e NaF efectivamente inhibiu a xelación, respectivamente (Fig. 5a, b; Fig. 2b complementario) e que estes sales aumentaron a estabilidade térmica dos monómeros NT (Fig. 5b, Fig. 8 complementario). .Tamén suxire que a mellora da estabilidade, en lugar da dimerización, impide a formación de xel.
Para explorar aínda máis o papel da dimerización das proteínas e da estabilidade na xelación, usamos dous mutantes, NT* e NTA72R, que tamén permanecen monoméricos a pH 28,30 baixos.NT* é un mutante de reversión de dobre carga no que a distribución de carga dipolar aparente do monómero é aplanada, o que impide a dimerización e aumenta drasticamente a estabilidade do monómero.NTA72R é un dipolo cargado, pero o Ala substituído por Arg está situado no límite do dímero, polo que as mutacións interfiren coas interaccións das subunidades necesarias para a dimerización.Tras a incubación a 37 ° C, NT * non formou un hidroxel, mentres que NTA72R formou un xel opaco durante 15 min (Fig. 5c).Dado que tanto NT * como NTA72R non poden dimerizar, pero difiren na estabilidade do monómero (Fig. 5d), estes resultados suxiren fortemente que a alta estabilidade termodinámica impide que NT se xele.Isto tamén está apoiado polo feito de que HT* forma un xel cando é inestable a alta temperatura (despois de 8 min a 60 °C; Fig. 5c).Previamente demostrouse que o alto contido de metionina en NT licua o seu pregamento natural e que seis substitutos de Met a Leu (referidos aquí como His-NT-L6) estabilizan fortemente o monómero NT46.Partindo da hipótese de que se require flexibilidade estrutural para a formación de xel NT, descubrimos que o mutante estable His-NT-L6 non se xelaba a 37 ° C (Figura 5c, d).Non obstante, His-NT-L6 tamén formou un xel tras a incubación a 60 ° C durante 60 min (Fig. 5c).
A capacidade do NT para transformarse en estruturas de folla β e formar hidroxeles parece aplicarse a algúns, pero non a todos, os dominios NT da spidroína.Os NT de diferentes tipos de seda e especies de arañas, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formaron xeles a pesar do seu contido relativamente baixo en metionina e a súa alta estabilidade térmica (Fig. 5e, f e Táboa complementaria 2).Pola contra, a NT da pequena espidroína da proteína ampular de Araneus ventricosus (NTMiSp) con baixa estabilidade térmica e alto contido en metionina non formou hidroxeles (Táboa complementaria 2 e figura 5e, f).Este último pode estar asociado á presenza de enlaces disulfuro intramoleculares29,47.De forma consistente, cando os enlaces disulfuro de NTMiSp foron reducidos, formou un hidroxel despois da incubación a 37 ° C durante 10 min (Fig. 5e).En conclusión, hai que sinalar que a flexibilidade estrutural é un criterio importante, pero non o único, para a formación dun xel a partir de NT.Outro factor que pode ser relevante é a propensión a formar fibrillas amiloides, e a análise coa base de datos de zipper e o algoritmo Waltz mostrou unha correlación entre a capacidade de formar xeles e a presenza de rexións amiloidoxénicas, así como a extensión das rexións previstas. para formar cremalleiras estéricas.Houbo unha correlación (Táboa complementaria 2 e figura complementaria 9).
A capacidade de NT para formar fibrillas e formar xeles en condicións favorables levounos a hipótese de que as fusións de NT con outros fragmentos de proteína aínda poden formar xeles con plena función dos socios de fusión.Para probar isto, introducimos proteína fluorescente verde (GFP) e purina nucleósido fosforilase (PNP) no extremo C-terminal do NT, respectivamente.As proteínas de fusión resultantes expresáronse en E. coli con rendementos finais moi elevados (cultivos en frasco de agitación de 150 mg/L e 256 mg/L para His-NT-GFP e His-NT-PNP, respectivamente), de acordo co mostrado. para Outras proteínas fusionadas a NT Ref.30. As proteínas de fusión His-NT-GFP (300mg/mL) e His-NT-PNP (100mg/mL) formaron xeles despois de 2 horas e 6,5 horas a 37 °C e, o que é importante, a fracción GFP mantívose sen cambios.observado despois da xelación, con> 70% da intensidade de fluorescencia inicial restante despois da xelación (Fig. 6a).Para medir a actividade do PNP en solucións e xeles his-NT-PNP, tivemos que diluír a proteína de fusión con NT porque a actividade enzimática da preparación pura estaba fóra do intervalo de detección do ensaio a concentracións de xelificación.O xel formado cunha mestura que contén 0,01 mg/mL de His-NT-PNP e 100 mg/mL de NT retivo o 65% da actividade enzimática inicial das mostras preincubadas (Fig. 6b).O xel permaneceu intacto durante a medición (figura complementaria 10).
a Intensidade de fluorescencia relativa antes e despois da xelación de His-NT-GFP (300 mg/mL) e vial invertido que contén hidroxel His-NT-GFP (300 mg/mL) baixo luz visible e UV.Os puntos mostran medidas individuais (n = 3), as barras de erro mostran a desviación estándar.O valor medio móstrase no centro das barras de erro.b A actividade do PNP obtívose mediante análise fluorométrica utilizando solucións e xeles formados por NT (100 mg/ml) e unha mestura que contén 0,01 mg/ml de his-NT-PNP e 100 mg/ml de novos dólares de Taiwán.O recuadro mostra un frasco invertido que contén un hidroxel que contén His-NT-PNP (barra de escala de 5 mm).
Aquí, informamos da formación de hidroxeles a partir de NT e outras proteínas de spidroína recombinantes incubando unha solución proteica a 37 ° C (Figura 1).Demostramos que a xelación está asociada á transformación das hélices α en capas β e á formación de fibrillas de tipo amiloide (figuras 3 e 4).Este achado é sorprendente xa que os NT son feixes globulares de cinco hélices enrolados coñecidos pola súa solubilidade extremadamente alta e alta estabilidade a concentracións >200 mg/ml a 4 °C durante varios días27.Ademais, os NTs replícanse facilmente despois da desnaturalización térmica a baixas concentracións de proteínas en µM.Segundo os nosos resultados, a formación de fibrillas require unha combinación de concentración de proteína > 10 mg/mL e temperatura lixeiramente elevada (Fig. 1).Isto é consistente coa idea de que as fibrillas amiloides poden formarse a partir de proteínas pregadas globularmente que están nun estado parcialmente despregado debido ás flutuacións térmicas en condicións fisiolóxicas 48 .Exemplos de proteínas que sofren esta conversión inclúen a insulina49,50, a β2-microglobulina, a transtiretina e a lisozima51,52,53.Aínda que NT é unha hélice α no seu estado nativo, aproximadamente o 65% da cadea polipeptídica é compatible coa formación de cremalleira estérica (Fig. 4e) 45 .Dado que o monómero é dinámicamente móbil46, pode expor estas rexións amiloidoxénicas potenciais a temperaturas moderadamente elevadas e a altas concentracións de proteína total pode alcanzar unha concentración crítica para a formación de fibrillas amiloides54.Seguindo este razoamento, atopamos unha correlación negativa entre a concentración de spidroína e o tempo de xelación (Fig. 1c), e se a conformación monomérica de NT está estabilizada por mutacións (NT*, His-NT-L6) ou pola adición de sal, pode evitar formación de hidroxeles (Fig. 5).
Na maioría dos casos, as fibrillas de amiloide desaparecen da solución como un precipitado, pero en determinadas condicións poden formar hidroxeles55,56,57.As fibrillas formadoras de hidroxel normalmente teñen unha relación de aspecto alta e forman redes tridimensionais estables mediante o enredo molecular,55,58 consistente cos nosos resultados.Para a formación de hidroxel in vitro, as proteínas adoitan despregarse total ou parcialmente, por exemplo, por exposición a disolventes orgánicos, temperaturas elevadas (70–90 °C) e/ou pH baixos (1,5–3,0)59,60,61,62.Os hidroxeles de spidroin descritos aquí non requiren un procesamento duro, nin requiren axentes de reticulación para estabilizar os hidroxeles.
Previamente informouse de que as repeticións de spidroin e os QD, que parecen sufrir un cambio de folla β durante a fiación da seda, forman hidroxeles.En comparación cos nosos descubrimentos, os tempos de incubación e/ou as temperaturas de incubación foron significativamente máis longos ou superiores, respectivamente, e os hidroxeles resultantes adoitan ser opacos (figura 7 e táboa complementaria 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. Ademais dos tempos de xel rápidos, os hidroxeles NT > 300 mg/ml (30 %) superaron a todos os outros hidroxeles de proteína de seda de araña recombinantes descritos, así como os hidroxeles naturais como xelatina, alxinato (2 %), agar (0,5 %). ) e coláxeno.(0,6%) (Figura 7 e táboas complementarias 1 e 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
O tempo de xel e o módulo elástico dos hidroxeles neste estudo comparáronse con outros hidroxeles a base de spidroína e con hidroxeles naturais seleccionados.Ofrécense referencias xunto cunha descrición das condicións de xelación.APS Persulfato de amonio, temperatura ambiente.Datos 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Parece que as arañas desenvolveron formas de evitar que a spidroin se xele durante o almacenamento.A pesar da alta concentración de proteínas na glándula da seda, a gran rexión de repetición asociada ao dominio terminal significa que a concentración aparente de NT e CT na glándula corresponde aproximadamente a 10-20 mg/ml, no límite deste estudo.necesario para a formación de hidroxel observada in vitro.Ademais, concentracións similares de sales 16 estabilizaron NT, como nas glándulas da seda (Fig. 5b).A conformación de NT estudouse no citosol de E. coli e descubriuse que está máis firmemente pregada que cando se examina in vitro, o que indica ademais que o sal ou outros factores impiden a súa agregación in vivo.Non obstante, a capacidade dos NT para transformarse en fibrillas de folla β pode ser importante para a formación de filamentos e debería ser investigada en estudos futuros.
Ademais dos novos aspectos da formación de fibrillas e hidroxel tipo amiloide NT observados neste estudo, tamén mostramos que este fenómeno pode ter aplicacións biotecnolóxicas e biomédicas (Fig. 8).Como proba de concepto, combinamos NT con GFP ou PNP e demostramos que a proteína de fusión tamén forma hidroxeles cando se incuba a 37 ° C e que as fraccións GFP e PNP manteñen en gran parte a súa actividade despois da xelación (Figura 6).As nucleósidos fosforilasas son importantes catalizadores de síntese de análogos de nucleósidos75, o que fai que o noso descubrimento sexa relevante para a industria biofarmacéutica.O concepto de expresar proteínas de fusión que forman hidroxeles transparentes en condicións favorables permite a creación de hidroxeles funcionalizados con propiedades favorables para unha ampla gama de aplicacións como a inmobilización enzimática, a liberación controlada de fármacos e a enxeñaría de tecidos.Ademais, NT e NT* son marcadores de expresión eficientes30, o que significa que NT e as súas variantes poden usarse para a produción de alto rendemento de proteínas de fusión solubles e a posterior creación de proteínas diana inmobilizadas en hidroxeles 3D.
NT é soluble, helicoidal α e estable a baixas concentracións (µM) e 37 °C.Á mesma temperatura, pero a concentracións crecentes (>10 mg/ml), o NT forma xeles formados por fibrillas de tipo amiloide.As proteínas de fusión NT tamén forman xeles fibrilares con fragmentos de fusión totalmente funcionais, o que permite inmobilizar varias proteínas en hidroxeles 3D usando NT.Abaixo: NT (PDB: 4FBS) e ilustracións de redes de fibra e estruturas de proteínas asociadas (asumidas e non debuxadas a escala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
As construcións (consulte a táboa complementaria 4 para obter unha lista completa que inclúe as secuencias de aminoácidos) clonáronse no plásmido pT7 e transformáronse en E. coli BL21 (DE3).Inoculáronse E. coli que conteñan plásmidos de enxeñería en caldo Luria complementado con kanamicina (70 mg/l) e creceron durante a noite a 30 °C e 250 rpm.Despois, o cultivo foi inoculado 1/100 en medio LB que contiña kanamicina e cultivouse a 30 °C e 110 rpm ata que a DO600 alcanzou 0,8.Para os estudos de RMN, as bacterias cultiváronse en medio mínimo M9 que contiña 2 g de D-glicosa 13C (Aldrich) e 1 g de cloruro de amonio 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) para o marcado de proteínas con isótopos.Baixa a temperatura a 20 graos Celsius e induce a expresión da proteína con isopropiltiogalactopiranósido 0,15 mM (concentración final).Despois da expresión da proteína durante a noite, as células recolléronse a 7278 × g, 4 ° C durante 20 min.Os gránulos celulares foron resuspendidos en Tris-HCl 20 mM, pH 8, e conxeláronse ata o seu posterior uso.As células descongeladas foron lisadas usando un disruptor celular (máquinas da serie TS, Constant Systems Limited, Inglaterra) a 30 kPa.Despois centrifugáronse os lisados ​​a 25.000 g durante 30 minutos a 4 °C.Para NTMiSp, o sedimento foi resuspendido en urea 2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8, e sonicado durante 2 min (2 s on/off, 65%), despois centrifugado de novo a 25.000 xg, 4 ° C. 30 min.Cargouse o sobrenadante nunha columna de Ni-NTA, lavouse con Tris-HCl 20 mM, imidazol 2 mM, pH 8, e finalmente a proteína eluíuse con Tris-HCl 20 mM, imidazol 200 mM, pH 8. Para xerar NT2RepCT e NTCT, a dixestión da trombina introduce o sitio (ThrCleav) entre His e NT.Os sitios de escisión da trombina tamén están presentes en His-NT-ThrCleav-2Rep (produce 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produce NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produce CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produce NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produce NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produce NTF1Sp) e His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produce NTMiSp).As construcións foron dixeridas con trombina (1:1000) e dializadas durante a noite a 4 °C con Tris-HCl 20 mM, pH 8, utilizando unha membrana de diálise Spectra/Por cun limiar de peso molecular de 6-8 kDa.Despois da diálise, a solución cárgase nunha columna de Ni-NTA e recóllese o efluente que contén a proteína de interese.As concentracións de proteínas determináronse medindo a absorbancia UV a 280 nm utilizando o coeficiente de extinción de cada proteína, excepto a NTF1Sp, que utilizou o ensaio de Bradford segundo o protocolo do fabricante.A pureza determinouse mediante electroforese en xel de poliacrilamida SDS (4-20%) e tinción azul brillante de Coomassie.As proteínas concentráronse usando filtros de centrífuga (VivaSpin 20, GE Healthcare) a 4000 xg cun corte de peso molecular de 10 kDa en ciclos de 20 minutos.
Desconxelar a solución de proteína e pipetear coidadosamente 150 µl nun vial transparente de 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Os tubos foron tapados e selados con parafilm para evitar a evaporación.As mostras (n = 3) incubáronse a 37 °C ou 60 °C e invertéronse periodicamente para observar a xelación.As mostras que non se xelaban incubáronse durante polo menos unha semana.Reducir os enlaces disulfuro NTMiSp con 10 mM de DTT por 10 µM de proteína.Para analizar a xelación dos revestimentos naturais de seda de araña, cortouse a araña ponte sueca, colocáronse as dúas glándulas ampuladas principais en 200 μl de tampón Tris-HCl 20 mM pH 8 e cortáronas para que o revestimento se separase das glándulas..O contido das glándulas disólvese en tampón, 50 µl para a determinación do peso seco (mediante incubación de frascos abertos a 60 °C ata peso constante) e 150 µl para a xelación a 37 °C.
A xeometría/ferramenta de medición está feita de aceiro inoxidable utilizando unha placa paralela cun diámetro superior de 20 mm e unha separación de 0,5 mm.Quenta a mostra de 25 °C a 45 °C e volve a 25 °C a unha velocidade de 1 °C por minuto usando unha placa Peltier de fondo de aceiro inoxidable.As medicións vibracionais realizáronse a unha frecuencia de 0,1 Hz e na rexión viscoelástica lineal do material cunha tensión do 5% e do 0,5% para mostras de 100 mg/mL e 300-500 mg/mL, respectivamente.Use unha cámara de humidade personalizada para evitar a evaporación.Os datos foron analizados usando Prism 9.
Para recoller espectros infravermellos (IR) a temperatura ambiente de 800 a 3900 cm–1.O dispositivo ATR, así como a traxectoria da luz a través do espectrómetro, púrgase con aire filtrado seco antes e durante o experimento.Disolucións (500 mg/mL para minimizar os picos de absorción de auga nos espectros) foron pipeteadas sobre os cristais, e os xeles (500 mg/mL) formáronse antes da medición e despois transferíronse aos cristais (n = 3).Graváronse 1000 exploracións cunha resolución de 2 cm-1 e un ciclo de traballo cero de 2. A segunda derivada calculouse mediante OPUS (Bruker) utilizando un rango de suavización de nove puntos.Os espectros normalizáronse á mesma rexión de integración entre 1720 e 1580 cm-1 usando F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.Na espectroscopia ATR-IR, a profundidade de penetración dun feixe infravermello nunha mostra depende do número de onda, o que resulta nunha absorción máis forte en números de onda máis baixos que en números de onda máis altos.Estes efectos non foron corrixidos para os espectros mostrados nas Figs.3 porque son moi pequenos (Figura complementaria 4).Os espectros corrixidos para esta figura calculáronse mediante o software Bruker OPUS.
En principio, é posible unha cuantificación completa das conformacións proteicas despois dunha deconvolución fiable dos compoñentes dentro do pico da amida I.Non obstante, na práctica xorden algúns obstáculos.O ruído no espectro pode aparecer como picos (falsos) durante a deconvolución.Ademais, o pico debido á flexión da auga coincide coa posición do pico da amida I e pode ter unha magnitude similar para mostras que conteñan unha gran cantidade de auga, como o xel acuoso que se estuda aquí.Polo tanto, non tentamos descompoñer completamente o pico da amida I, e as nosas observacións só deberían considerarse como apoio a outros métodos como a espectroscopia de RMN.
As solucións de 50 mg/ml NT e His-NT2RepCT gelificáronse durante a noite a 37 °C.Despois diluíuse o hidroxel con Tris-HCl 20 mM (pH 8) ata unha concentración de 12,5 mg/ml, sacudiuse ben e pipeteouse para romper o xel.A continuación, o hidroxel diluíuse 10 veces con Tris-HCl 20 mM (pH 8), aplicáronse 5 μl da mostra a unha reixa de cobre recuberta con formvar e eliminouse o exceso de mostra con papel secante.As mostras laváronse dúas veces con 5 µl de auga MilliQ e tinguironse con formiato de uranilo ao 1% durante 5 minutos.Elimina o exceso de mancha con papel absorbente, despois seca a malla ao aire.A imaxe realizouse nestas reixas mediante un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN que funciona a 100 kV.As imaxes graváronse con aumentos de x 26.500 e x 43.000 usando unha cámara CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemaña).Para cada mostra (n = 1), graváronse de 10 a 15 imaxes.Utilizouse ImageJ (https://imagej.nih.gov/) para a análise de imaxes e a medición de diámetros de fibras (n = 100, fibras diferentes).Utilizouse Prism 9 para realizar probas t sen pares (de dúas colas).As fibrillas medias de His-NT2RepCT e NT foron 11,43 (SD 2,035) e 7,67 (SD 1,389) nm, respectivamente.O intervalo de confianza (95%) é de -4,246 a -3,275.graos de liberdade = 198, p < 0,0001.
80 µl de mostras líquidas que conteñen 10 µM de tioflavina T (ThT) midéronse por triplicado (n = 3) en condicións estáticas utilizando placas de fondo transparente de fondo negro Corning de 96 pocillos (Corning Glass 3881, EUA).As diferenzas de fluorescencia rexistráronse mediante un filtro de excitación de 440 nm e un filtro de emisión de 480 nm (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenburg, Alemaña).O sinal ThT non estaba saturado nin apagado, xa que se realizaron experimentos con diferentes concentracións de ThT sen cambiar a intensidade do sinal.Rexistrar a absorbancia a 360 nm para medir a neblina.Para os experimentos de sementeira, formáronse xeles de 100 mg/mL a 37 °C, resuspendidos e utilizados para sementar en proporcións molares do 5%, 10% e 20%.Os datos foron analizados usando Prism 9.
Desconxelar as existencias de His-NT2RepCT e NT >100 mg/ml en xeo e filtrar a través dun filtro de 0,22 µm.As concentracións calculáronse medindo a absorbancia a 280 nm usando Nanodrop.En pocillos dunha placa negra non enlazante de 96 pocillos (Corning) cun fondo claro, as mostras diluíronse a 20 mg/ml en Tris-HCl 20 mM pH 8 e mesturáronse con ThT 5 μM (concentración final), concentración total da mostra. Volume de 50 μl.As mostras foron tomadas cada 10 minutos a 37 °C nun microscopio CellObserver (Zeiss) con canle de luz transmitida e conxuntos de filtros de excitación e emisión FITC para imaxes ThT.Utilízase unha lente de 20x/0,4 para a imaxe.Utilizáronse Zen Blue (Zeiss) e ImageJ (https://imagej.nih.gov/) para a análise de imaxes.Tamén se prepararon xeles a partir de solucións de NT e His-NT2RepCT a unha concentración de 50 mg/ml que conteñen Tris 20 mM pH 8 e 5 µM ThT e incubáronse a 37 °C durante 90 min.As pezas de xel foron transferidas a un novo pozo que contén 20 mM de Tris, pH 8 e 5 μM de ThT nunha placa de fondo transparente de 96 pozos negro non vinculante.Adquira imaxes de fluorescencia verde e de campo brillante cun aumento de 20x/0,4.Utilizouse ImageJ para a análise de imaxes.
Os espectros de RMN en solución obtivéronse a 310 K nun espectrómetro Bruker Avance Neo de 600 MHz equipado cunha criosonda de campo de gradiente pulsado de resonancia cuádrupolo QCI (HFCN).Mostras de RMN que conteñen 10 mg/mL de proteína homoxénea marcada con 13C, 15N, disolta en Tris-HCl 20 mM (pH 8), 0,02 % (p/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Utilizáronse os desprazamentos químicos de NT2RepCT a pH 6,7 para asignar o pico 23 no espectro 2D de 15N-HSQC.
Os espectros de RMN de sólidos rotativos de ángulo máxico (MAS) de hidroxeles marcados con 13C e 15N foron rexistrados nun espectrómetro Bruker Avance III HD a 800 MHz equipado cunha sonda sen electróns 13C/15N{1H} de 3,2 mm.A temperatura da mostra controlouse mediante un fluxo de gas de temperatura variable a 277 K. Os espectros de resonancia rotacional dipolo bidimensional (DARR)76 e de reconexión de radiofrecuencia (RFDR)77 foron adquiridos a frecuencias MAS de 12,5 kHz e 20 kHz, respectivamente.A polarización cruzada (CP) de 1H a 13C realizouse mediante unha rampla lineal de 60,0 a 48,0 kHz a 1H, 61,3/71,6 kHz a 13C (a 12,5/20 kHz MAS) e tempo de contacto 0,5-1 ms.Durante a recollida de datos utilizouse o desacoplamento Spinal6478 a 73,5 kHz.O tempo de adquisición foi de 10 milisegundos e o retraso do ciclo foi de 2,5 segundos.As correlacións unilaterales Cα/Cβ observadas nos espectros RFDR asignáronse en función dos desprazamentos químicos característicos do tipo de residuo e das correlacións de enlaces múltiples nos espectros DARR.
Utilizouse a base de datos Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) para avaliar as tendencias do flutter e a enerxía de Rosetta para NT, NTFlSp e NTMiSp.A base de datos Zipper calcula Rosetta Energy80, que combina varias funcións de enerxía libre para modelar e analizar a estrutura das proteínas.Un nivel de enerxía de -23 kcal/mol ou inferior indica unha alta tendencia a fibrilar.A menor enerxía significa máis estabilidade das dúas cadeas β na conformación da cremalleira.Ademais, utilizouse o algoritmo Waltz para predicir rexións amiloidoxénicas en NT, NTFlSp e NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
A solución de proteína NT mesturouse con tampón de ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico (MES) a pH 5,5 e 6,0 para baixar o pH a pH 6 e 7, respectivamente.A concentración final de proteína foi de 100 mg/ml.
As medicións realizáronse nun espectrómetro J-1500 CD (JASCO, EUA) utilizando unha cubeta de 300 μL cun camiño óptico de 0,1 cm.As proteínas diluíronse a 10 μM (n = 1) en tampón fosfato 20 mM (pH 8).Para analizar a estabilidade das proteínas en presenza de sal, analizáronse as proteínas á mesma concentración (n = 1) en tampón fosfato 20 mM (pH 8) que contiña NaF ou NaCl 154 mM, respectivamente.Os escaneos de temperatura rexistráronse a 222 nm de 25 °C a 95 °C cunha velocidade de quecemento de 1 °C/min.A proporción de proteínas pregadas nativamente foi calculada mediante a fórmula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Ademais, rexistráronse cinco espectros para cada mostra de 260 nm a 190 nm a 25 °C e despois de quentar a 95 °C.Promediaron cinco espectros, suavizáronse e convertéronse en elipticidade molar.Os datos foron analizados usando Prism 9.
A intensidade de fluorescencia de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) foi medida por triplicado (n = 3) en placas Corning de 96 pocillos cun fondo negro transparente (Corning Glass 3881, EUA) en condicións estáticas.Mida as mostras cun lector de placas baseado en fluorescencia cunha lonxitude de onda de excitación de 395 nm e rexistre a emisión a 509 nm antes da xelación e 2 horas despois a 37 °C.Os datos foron analizados con Prism 9.
Utilizouse o kit de ensaio da actividade de purina nucleósido fosforilase (método fluorométrico, Sigma Aldrich) segundo as instrucións do fabricante.Para medir a actividade en xeles e solucións que conteñan His-NT-PNP, mestura 10 ng de His-NT-PNP con 100 mg/ml de NT ata un volume total de 2 µL porque o xel deu un sinal por riba do intervalo de detección do conxunto.Incluíronse controis para xeles e solucións sen His-NT-PNP.As medicións realizáronse dúas veces (n = 2).Despois de medir a actividade, eliminouse a mestura de reacción e fotografouse o xel para garantir que o xel permanecía intacto durante a medición.Os datos foron analizados usando Prism 9.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulte o resumo do estudo Nature vinculado a este artigo.
As figuras 1 e 2 presentan os datos iniciais.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f e 6, figuras complementarias.3, figura complementaria.5a, d, fig.6 e fig.8. Datos Os datos deste estudo están aloxados na base de datos Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Os datos de RMN obtidos neste estudo foron publicados no repositorio BMRBig baixo o ID de entrada bmrbig36.As estruturas de GFP e PNP foron tomadas de PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. e Johansson, J. Spinning artificial seda de araña.Química Nacional.bioloxía.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.O xenoma de Nephila clavipes destaca a diversidade de xenes da seda de araña e a súa complexa expresión.Genette Nacional.49, 895–903 (2017).